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May 16, 2023

Charakterisierung der Zytoskelett- und Struktureffekte von INF2-Varianten, die Glomerulopathie und Neuropathie verursachen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12003 (2023) Diesen Artikel zitieren 332 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ist eine häufige glomeruläre Schädigung, die zu führt

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12003 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ist eine häufige glomeruläre Schädigung, die zu einer Nierenerkrankung im Endstadium führt. Monogenes FSGS wird in erster Linie auf eine verminderte Podozytenintegrität zurückgeführt. Varianten zwischen den Resten 184 und 245 von INF2, einem Aktin-Assemblierungsfaktor, erzeugen den monogenen FSGS-Phänotyp. Unterdessen verursachen Varianten zwischen den Resten 57 und 184 eine doppelseitige Erkrankung, die periphere Neuronen und Podozyten betrifft (Charcot-Marie-Tooth CMT/FSGS). Um die molekulare Grundlage für INF2-Störungen zu verstehen, verglichen wir die strukturellen und zytoskelettalen Auswirkungen von INF2-Varianten, die in zwei Untergruppen eingeteilt wurden: Eine (G73D, V108D) verursacht den CMT/FSGS-Phänotyp und die andere (T161N, N202S) produziert monogenes FSGS. Die Analyse der Molekulardynamik ergab, dass alle INF2-Varianten im Vergleich zum Wildtyp-INF2 eine deutliche Flexibilität aufweisen und die Stabilität einer intramolekularen Wechselwirkung zwischen ihren N- und C-terminalen Segmenten beeinträchtigen könnten. Die Immunzytochemie von Zellen, die INF2-Varianten exprimierten, zeigte weniger Aktin-Stressfasern und eine Desorganisation der zytoplasmatischen Mikrotubuli-Arrays. Bemerkenswert ist, dass CMT/FSGS-Varianten deutlichere Veränderungen in der mitochondrialen Verteilung und Fragmentierung verursachten als FSGS-Varianten, und diese Veränderungen korrelierten mit der Schwere der Störung des Zytoskeletts. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CMT/FSGS-Varianten mit schwerwiegenderen globalen Zelldefekten verbunden sind, die durch gestörte Wechselwirkungen zwischen Zytoskelett und Organellen verursacht werden, als FSGS-Varianten. Weitere Studien sind erforderlich, um gewebespezifische Signalwege und/oder Zellfunktionen zu klären, die an FSGS- und CMT-Phänotypen beteiligt sind

Fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ist eine klinisch-pathologische Erkrankung, die durch eine einzigartige Verteilung glomerulärer Narben gekennzeichnet ist, die einen Teil des Nephrons (fokal) und einen Teil der Kapillarbüschel (segmental) betreffen1. Patienten mit FSGS zeigen klinisch ein steroidresistentes nephrotisches Syndrom (SRNS) und eine fortschreitende Verschlechterung der Nierenfunktion. Bisher wurde berichtet, dass über 60 Gene mit monogenem SRNS2 assoziiert sind. Die meisten SRNS-Gene werden in glomerulären Podozyten exprimiert, was die Schlüsselrolle von Podozyten bei der Aufrechterhaltung der Filtrationsbarrierefunktion unterstreicht. Podozyten erzeugen Schlitzdiaphragmen zwischen mit Aktin angereicherten Fußfortsätzen und passen sich an Filtrationsstress an, indem sie Veränderungen in der Zellform regulieren, die durch die dynamische Reorganisation von Aktinnetzwerken vermittelt werden3.

Mutationen im invertierten Formin-2-Gen (INF2) sind die häufigste Ursache (12–17 %) für autosomal-dominantes FSGS4,5. INF2 gehört zur diaphanen Unterfamilie der Formine, die als Aktin-Assemblierungsfaktoren in einer Reihe von Zellfunktionen fungieren, darunter Zellmigration, Vesikeltransport, Organellendynamik und Positionierung6. INF2 kodiert für ein Multidomänenprotein, das die zentralen Forminhomologiedomänen 1 (FH1) und 2 (FH2) umfasst, flankiert von der N-terminalen diaphanösen Hemmdomäne (DID) und der C-terminalen diaphanösen autoregulatorischen Domäne (DAD). INF2 verfügt über die einzigartige Fähigkeit, sowohl die Polymerisation als auch die Depolymerisation von Aktin zu beschleunigen. Die Depolymerisationsaktivität wird durch das intramolekulare Zusammenspiel zwischen DID und DAD7 negativ gehemmt. DID-Mutationen verursachen INF2-bedingte Störungen im Zusammenhang mit einer fehlregulierten Autoinhibition, die das INF2-Molekül konstitutiv aktiv macht. INF2 interagiert auch mit der Rho-Familie kleiner GTPasen, anderen Mitgliedern der Formin-Familie und zellulären Regulatoren, um die Organisation von aktinbasierten Strukturen wie Lamellipodien, Filopodien und Stressfasern zu orchestrieren6.

INF2-Mutationen wurden ursprünglich in dominanten Familien mit alleinigem FSGS identifiziert8. Über 60 krankheitsbedingte INF-Mutationen sind ausschließlich auf die DID zurückzuführen, die von den INF2-Exons 2–49,10 kodiert wird. In seltenen, weitgehend sporadischen Fällen verursachen neben FSGS9 auch andere INF2-Mutationen eine periphere Neuropathie im Zusammenhang mit der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit (CMT-DIE, MIM#614455). INF2-Mutationen, die FSGS allein oder FSGS/CMT-Doppelphänotypen verursachen, segregieren in bestimmten Regionen der DIS. Varianten in der proximalen Hälfte des DID (Reste Leu57 bis Glu184) verursachen typischerweise CMT mit früh einsetzendem FSGS, während Varianten in der distalen Hälfte (Reste Glu184 bis Leu245) allein zu spät einsetzendem, mildem FSGS führen10. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, wie sich diese INF2-Mutationen deutlich auf zwei Zelllinien, Podozyten und Schwann-Zellen, auswirken könnten. INF2-Mutationen sind mit einer Desorganisation des Zytoskeletts und einer veränderten Mitochondriendynamik, endosomalem Transport/Targeting und Wechselwirkungen mit mDia verbunden, einem Formin-Protein, dessen Aktivität durch INF28,9,11,12,13,14 ausgeglichen wird.

Der Grund, warum das gleichzeitige Auftreten von CMT und FSGS mit INF2-DID-Mutationen zusammenhängt, die sich ausschließlich in der proximalen Region des DID häufen, ist jedoch unklar.

Um die molekulare Basis von INF2-Störungen besser zu verstehen, haben wir in unserer Studienkohorte die strukturellen und zellulären Auswirkungen von INF2-Varianten zwischen zwei unterschiedlichen Subtypen verglichen: Einzel-FSGS-Erkrankungen und duale CMT/FSGS-Erkrankungen. Strukturelle und molekulardynamische Analysen ergaben, dass alle untersuchten Mutationen im Allgemeinen die molekulare Stabilität intermolekularer DID- und DAD-Wechselwirkungen verändern. Diese Veränderung beeinträchtigt wahrscheinlich die Effizienz und/oder Häufigkeit der INF2-Autoinhibition. Die Modellierung ergab jedoch keine offensichtlichen Unterschiede in den strukturdynamischen Eigenschaften zwischen den beiden phänotypischen Untergruppen. Die Immunzytochemie von Zellen, die INF2-Varianten exprimieren, ermöglichte die Visualisierung unterschiedlicher Zytoskeletteffekte zwischen den CMT/FSGS- und FSGS-Untergruppen. Die CMT/FSGS-Varianten hatten eine desorganisierte Architektur sowohl von Aktin als auch von Mikrotubuli, die die primär betroffenen Zellkomponenten sind und grundsätzlich mit denen der FSGS-Varianten identisch sind. Allerdings verursachen die CMT/FSGS-Varianten eine ausgeprägtere Desorganisation des Zytoskeletts als die FSGS-Varianten und haben wiederum einen schwerwiegenderen Einfluss auf die Größe, Form und Verteilung der Mitochondrien.

Wir haben zehn Familien untersucht, von denen fünf einem dominanten Übertragungsmuster folgten (Abb. 1).

Stammbäume mit INF2-Mutationen, die duale CMT- und FSGS- oder einzelne FSGS-Phänotypen aufweisen. Für jede Familie wird die Trennung der INF2-Varianten angezeigt. Quadrate und Kreise kennzeichnen männliche bzw. weibliche Probanden. Schrägstriche kennzeichnen verstorbene Personen und Pfeile kennzeichnen Indexpatienten. FSGS: Fokale segmentale Glomerulosklerose, CMT: Charcot-Marie-Tooth-Krankheit. E: Untersuchung, PE: körperliche Untersuchung, u, nicht aussagekräftig; WT: Wildtyp

Die klinischen Merkmale der 10 Indexpatienten mit INF2-Mutationen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Sechs Personen zeigten nur FSGS, während die anderen fünf Personen CMT- und FSGS-Doppelphänotypen (CMT/FSGS) aufwiesen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten4,5,8,9 umfassten die klinischen Manifestationen von Personen mit FSGS allein typischerweise eine Proteinurie, die von mäßig bis nephrotisch reichte und im frühen Jugend- bis Erwachsenenalter auftrat. Einige Personen zeigten Mikrohämaturie und Bluthochdruck. Der Beginn der Proteinurie in der FSGS-Untergruppe manifestierte sich zu unterschiedlichen Zeitpunkten von der Kindheit bis zum Erwachsenenalter (Bereich 8–30 Jahre, mittleres Alter 16 Jahre) und entwickelte sich im Allgemeinen im dritten bis vierten Stadium zu einer terminalen Nierenerkrankung (ESRD). Lebensjahrzehnt (Ergänzungstabelle S1). Bemerkenswert ist, dass Personen mit CMT/FSGS früher an Proteinurie erkrankten (im Alter von 6 bis 14 Jahren, im Median 11 Jahre alt) und sich schneller zu terminaler Niereninsuffizienz entwickelten (im Alter von 12 bis 17 Jahren, im Median 15 Jahre alt) als Personen mit FSGS allein (Bereich 13–36 Jahre, Median 24 Jahre) (Ergänzungstabelle S1, S2). Die Kaplan-Meier-Analyse bestätigte, dass Personen in der CMT/FSGS-Untergruppe früher SRNS aufwiesen und schneller zu ERSD übergingen (P < 0,01) (ergänzende Abbildung S1). Die Lichtmikroskopie von Nierenbiopsieproben aus den beiden Untergruppen zeigte eine Reihe histologischer Befunde von minimalen Veränderungen bis hin zu FSGS. Die histologischen Ergebnisse konnten größtenteils in „FSGS, nicht anders angegeben (NOS)“1 subtypisiert werden. Bei einigen Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung wurde nur eine diffuse globale glomeruläre Sklerose festgestellt. Eine Immunfluoreszenzstudie ergab mit einer Ausnahme nur unspezifische IgM- und C3-Ablagerungen: Bei einem Indexpatienten (Fall 4, II-1) wurde zunächst eine IgA-Nephropathie diagnostiziert. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass der Fußfortsatz der Podozyten in Abwesenheit elektronendichter Ablagerungen verschwand.

Die fünf Personen mit CMT/FSGS hatten ab einem Alter von 10 bis 15 Jahren Schwierigkeiten beim Gehen mit Muskelschwund und Schwäche in den unteren Gliedmaßen. Die neurologischen Symptome traten erstmals in einem Alter auf, das denen einer Proteinurie ähnelte (Ergänzungstabelle S2). Die periphere Neuropathie beeinträchtigte bevorzugt die motorische Funktion der distalen unteren Extremitäten.

Elektrophysiologische Studien ergaben bei zwei Individuen mediane Nervenleitungsgeschwindigkeiten (MCV) im mittleren Bereich (25–45 m pro Sekunde)15, und die anderen drei zeigten ein vorherrschendes demyelinisierendes Merkmal (MCV < 20 m pro Sekunde) ohne erregbares Profil oder mehrschichtige Zwiebel Zwiebelbildung. In einem Fall wurde ein Hörverlust festgestellt (Fall 10).

Wir fanden 10 heterozygote Missense-INF2-Varianten bei sechs familiären und vier sporadischen FSGS-Individuen. Alle 10 Varianten sind an hochkonservierten Resten in den Exons 2 bis 4 lokalisiert, die für die INF2-DID kodieren (ergänzende Abbildung S2). In-silico-Analysen ergaben, dass diese Mutationen sicherlich schädlich sind. Darüber hinaus waren diese Varianten bei 10.000 gesunden Kontrollpersonen mit übereinstimmender ethnischer Zugehörigkeit (jMorp) oder einer großen Populationsdatenbank mit über 246.000 Chromosomen (gnomAD) nicht vorhanden (Tabelle 1). Insbesondere befinden sich Mutationen, die allein FSGS verursachen, in der distalen Hälfte der DIS. Im Gegensatz dazu verteilen sich diejenigen, die mit dem dualen CMT/FSGS-Phänotyp assoziiert sind, in der proximalen N-terminalen Hälfte der DIS (Abb. 2). Die p.T161N- und p.L162P-Mutationen traten in einer Grenzregion auf, die die Mutationscluster von CMT/FSGS von der FSGS-Untergruppe trennt5.

Standorte von Varianten in der INF2-Domänenstruktur. Die Verteilung der Varianten in INF2-Funktionsdomänen wird gezeigt. Varianten in Exon 2 wurden bei Personen mit einem dualen Phänotyp der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit (CMT) und FSGS gefunden, während Varianten in Exon 3 und Exon 4 bei Patienten mit FSGS allein identifiziert wurden. INF2 ist ein großes Multidomänenprotein, das aus drei funktionellen Domänen besteht: der durchsichtigen inhibitorischen Domäne (DID, orange), den Forminhomologiedomänen (FH) FH1 und FH2 (rot und grün) und der durchsichtigen autoregulatorischen Domäne (DAD, blau). Das DID interagiert mit dem DAD innerhalb desselben Moleküls (intramolekulare Autoinhibition) sowie mit anderen Aktinregulatoren (z. B. kleine GTPase und mDia). Die FH-Domänen vermitteln sowohl die Aktinpolymerisation als auch die Depolymerisation. Domänenpositionen entsprechen UniprotKB-Q27J81. WH2: WASP-Homologie 2; mDia: Säugetier-Diaphanous-verwandtes Formin 1.

Um die Auswirkungen der Mutationen auf die Struktur von menschlichem INF2 zu bewerten, haben wir zunächst die pathogenen Varianten im DID modelliert, wobei wir die Kristallstruktur des Maus-mDia1-DID/DAD-Komplexes als Grundlage verwendeten16,17. Die Seitenketten der hydrophoben Reste der DAD-Domäne schienen mit den DID-Bindungstaschen zu interagieren, die durch die α-Helices α7, α10 und α13 der Armadillo-Repeats (ARM) gebildet werden (Abb. 3, ergänzende Abbildung S2, S3). Dieses Strukturmodell stimmte mit dem überein, das aus dem Deep-Learning-basierten AlphaFold2-Programm18 abgeleitet wurde (Ergänzungsabbildung S4). In diesem Modell wurden die CMT/FSGS-Varianten in der Nähe des zentralen Kerns der hydrophoben DAD-Bindungstasche kartiert, während die FSGS-Varianten in weiter außen liegenden Teilen auftraten.

Strukturmodellierung von menschlichem INF2. Eine 3D-Struktur von menschlichem INF2, modelliert auf der komplexen mDia1-DID-DAD-Kristallstruktur (PDB 2F31)16 unter Verwendung des Rosetta-Programms. (A) Standorte für zehn pathogene Varianten im DID werden als Banddiagramme dargestellt; Blau: L69P, G73D (G73V), Orange: V108D, Magenta: G157R, T161N, L162P, Rosa: N202S, R218W, E220K. Basierend auf diesem Modell wird vorhergesagt, dass die α-Helix des N-terminalen DAD (türkis) die Kerntasche des DID berührt. Seitenketten ausgewählter Reste, die an den DID/DAD-Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in Stiftform dargestellt: N110 und Y153 in DID, E969, V972 und L976 in DAD. Die zentralen α-Helices α7, α10, α13 aus der 2., dritten bzw. vierten Armadillo-Wiederholung erzeugen die DID-Bindungstaschen. (B) Kern-DID-DAD-Interaktion. Der DID wird als horizontal um 180˚ gedrehte Oberflächendarstellung dargestellt. Es wird vorhergesagt, dass die Reste E969, V972, L976 im N-terminalen DAD direkten Kontakt mit den oberflächenexponierten Partnern N110, Y153 in der hydrophoben Bindungstasche von DID herstellen.

Als nächstes untersuchten wir DID/DAD-Wechselwirkungen in pathogenen INF2-Varianten durch Strukturmodellierung. PDBsum-Interaktionsdiagramme zeigten, dass die DID-DAD-Schnittstelle pathogener INF2-Varianten im Vergleich zum Wildtyp deutliche Veränderungen sowohl in der Aminosäurepaarung als auch in der Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen aufweist (ergänzende Abbildung S5). Die Grenzflächenfläche und die freie Lösungsmittelenergie (ΔG) unterschieden sich jedoch nicht signifikant und scheinen die Gesamtbindungsaffinität der DID/DAD-Wechselwirkung nicht zu verändern. (Ergänzungstabelle S3)19. Modellierungsanalysen deuten darauf hin, dass die strukturellen Auswirkungen von INF2-Varianten möglicherweise subtile Änderungen im Interaktionsmuster und die Notwendigkeit einer Bewertung ihrer Molekulardynamik sind.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen von INF2-Missense-Mutationen auf die dynamische Flexibilität und Stabilität des DID-DAD-Komplexes. Die Molekulardynamik von INF2-Proteinen wurde zwischen dem Wildtyp und fünf pathogenen Varianten durch vergleichende Modellierung mit dem Rosetta-Programm und Molekulardynamik-Simulation (MD) mit dem GROMACS-Programm verglichen. Wir haben zunächst auf die Gesamtstrukturstabilität des Wildtyp-DID-DAD-Komplexes zugegriffen, indem wir die Trajektorien der quadratischen Mittelabweichung (RMSD) ihrer Rückgratatome während der 500-ns-Simulation analysiert haben. Der RMSD stieg über die anfänglichen 50 bis 100 ns auf etwa 0,5 nm an und erreichte bis zum Ende des Simulationszeitraums von 500 ns ein Plateau (Abb. 4). Fünf INF2-Varianten zeigten RMSD-Trajektorien, die zwischen 50 ns und 100 ns ähnlich wie beim Wildtyp ausgeglichen wurden, mit Ausnahme von T161N, das einen allmählichen Anstieg des RMSD zeigte, der sich bei etwa 200 ns stabilisierte. Beim Vergleich der Trajektorien im stationären Zustand zeigten die Varianten ein unterschiedliches Ausmaß an Veränderungen im gesamten durchschnittlichen RMSD: Die G73D-Variante zeigte den größten durchschnittlichen RMSD-Wert (0,71 nm gegenüber 0,52 nm beim Wildtyp), während L69P im Vergleich dazu einen minimal erhöhten Wert aufwies der Wildtyp (0, 55 nm) (Ergänzungstabelle S4). Im Gegensatz dazu zeigten die anderen drei (T161N, R218W, E220K) im Vergleich zum Wildtyp eine leichte Abnahme des RMSD (0,44–0,46 nm). Die Variation im globalen RMSD der INF2-Varianten legt nahe, dass die Konformationsänderungen im Proteinkomplex während der gesamten Simulation stattfinden können.

Vergleich der Molekulardynamik zwischen INF2-Wildtyp und -Varianten anhand von RMSD-Diagrammen (Root Mean Square Deviation). RMSD-Werte (nm) werden über die 500 ns (ns) MD-Simulationen unter der Annahme einer wässrigen Lösung aufgetragen. Ein paarweiser Vergleich der Trajektorien zwischen Wildtyp-INF2 und Varianten zeigt, dass die krankheitsverursachenden Varianten im Vergleich zum Wildtyp-INF2 (WT) eine deutliche Flexibilität des DID-DAD-Autoinhibitionskomplexes aufweisen. Der RMSD des WT steigt über die ersten 50 bis 100 ns auf bis zu 0,5 nm an und erreicht bis zum Ende des Simulationszeitraums von 500 ns ein Plateau. Im stationären Zustand weist die G73D-Variante eine höhere Molekulardynamik auf, während L69P eine minimale Änderung zeigt, die mit der WT vergleichbar ist. Im Gegensatz dazu zeigen die anderen drei Varianten (T161N, R218W und E220K) einen geringfügigen Rückgang des RMSD als der WT.

Um mehr Einblicke in die veränderte Stabilität/Flexibilität des DID-DAD-Komplexes zu gewinnen, haben wir die Fluktuation der einzelnen Aminosäurereste innerhalb der Komplexe geschätzt, indem wir die quadratische Mittelfluktuation (RMSF) für die Rückgratatome von Wildtyp-INF2 und gemessen haben Varianten. RMSF schätzt die durchschnittliche Abweichung jedes Rückstands von der Referenzposition innerhalb der starr minimierten Strukturen über die Zeit der MD-Simulation. Die RMSF-Analyse des Wildtyp-INF2-DID-DAD-Komplexes ergab deutliche Schwankungen in den vier Clustern: zwei Regionen mit den höchsten Schwankungen umfassten die Reste 80–96 und 152–164 (> 0,3 nm Abweichung von den Referenzpositionen), während die anderen beiden mäßig schwankten schwankende Regionen bei den Resten 180–194 und 208–220 (ca. 0,1–0,2 nm) (Abb. 5). Diese vier Cluster mit höherem RMSF entsprechen den Schleifensegmenten, die die α-Helices der DID-Domäne verbinden, deren Konformation Berichten zufolge für die Interaktion mit der DAD-Domäne entscheidend ist (Ergänzende Abbildung S2 – S6)16.

Vergleich der Molekulardynamik zwischen INF2-Wildtyp und -Varianten anhand von RMSF-Diagrammen (Root-Mean-Square Fluktuation). RMSF-Scores werden pro Rest der INF2-DID-Domäne basierend auf den Cα-MD-Simulationen über 500 ns unter der Annahme einer wässrigen Lösung angezeigt. Wir haben die Simulationstrajektorien der letzten 400 ns verwendet, dem Zeitintervall, in dem die Struktur stabil geworden ist. Ein paarweiser Vergleich der Trajektorien zwischen Wildtyp-INF2 (WT) und pathogenen Varianten zeigt die veränderten Restfluktuationen in der DID-Domäne. Die Regionen mit den höchsten (80–96, 152–164) und mäßig-starken Schwankungen (180–194, 204–220) im WT und in den pathogenen Varianten werden durch einen hellrosa bzw. hellblau schattierten Hintergrund hervorgehoben. Der erste Fluktuationspeak bei den Resten 80–96 ist erhöht (L69P), wird mit der Spaltung breiter (T161N), verringert (G73D, E220K) und bleibt unverändert (R218W). Der zweite Schwankungspeak bei den Resten 152–164 geht für vier Varianten (G73D, T161N, R218W, E220K) verloren, während er für L69P erhalten bleibt. Die Konsens-Sekundärstruktur ist schematisch mit α-Helices (grün) und Schleifen (rosa) dargestellt.

Ein Vergleich der RMSF-Daten zwischen Wildtyp-INF2 und Varianten ergab Unterschiede in der Rückstandsdynamik in der DID-Domäne für die pathogenen Varianten. Erstens zeigte die L69P-Variante in den ersten Clusterresten 80–96 eine erhöhte Amplitude, während T161N eine Verbreiterung am Höhepunkt der Schwankungen aufwies. Die anderen beiden Varianten (G73D und E220K) zeigten eine leicht verringerte Schwankungsamplitude. Der verbleibende (R218W) zeigte bei diesem Peak geringfügige oder nicht unterscheidbare Unterschiede. Zweitens verloren in den Resten 152–160 des zweiten Clusters alle Varianten (G73D, T161N, R218W, E220K) den normalen Fluktuationspeak, mit Ausnahme der L69P-Variante, die die Flexibilität in diesem Bereich beibehielt. Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass die pathogenen INF2-Mutationen variable Veränderungen in der Konformationsflexibilität der DID-Domäne verursachen könnten.

Als nächstes bewerteten wir die Restwechselwirkungen an der DID-DAD-Schnittstelle von INF2-Varianten. Wir verglichen zunächst die Flexibilität des Glu968-Restes an der DID-DAD-Schnittstelle, indem wir zwei Schnappschüsse der dynamischen INF2-Struktur überlagerten, die bei 0 ns und 500 ns simuliert wurden, wobei letzterer den letzten Frame von Trajektorien darstellte, die ihren stabilen Dynamikzustand erreichten. Die überlagerten Bilder zeigten, dass die Glu968-Reste an der Schnittstelle im Vergleich zum Wildtyp eine variable Mobilität zwischen den pathogenen Varianten aufweisen (Abb. 6).

Vergleich der Restmobilität an der DID-DAD-Schnittstelle zwischen Wildtyp-INF2 und fünf pathogenen Varianten. Die Molekulardynamik menschlicher INF2-Strukturen wird mit dem Programm GROMACS simuliert, wobei davon ausgegangen wird, dass das Protein in Wasser mit Salz solvatisiert ist. Bilder dynamischer Strukturen werden mit VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) erfasst und zwischen Wildtyp-INF2 (WT) und pathogenen Varianten verglichen. Der DAD-Rest Glu968, der an der DID-DAD-Wechselwirkung beteiligt ist, ist als Index-Tracking-Marker angegeben (Pfeil bei t = 0 ns; Pfeilspitzen bei t = 500 ns). (A) Mobilität des Glu968-Rests in Wildtyp-INF2. Es werden überlagerte Bilder bei 0 ns (grün) und 500 ns (cyan) angezeigt. Die Position von Glu968 bei 500 ns (Pfeilspitze, rot) weicht von der der Referenz zum Zeitpunkt 0 ns (Pfeil gelb) ab, was darauf hinweist, dass der Glu 968-Rest von Wildtyp-INF2 während der 500 ns-MD-Simulation mobil ist. (B–E) Mobilität des Glu968-Restes in pathogenen INF2-Varianten. Dynamische Strukturen von Wildtyp- (Cyan) und INF2-Varianten (L69P, G73D, T161N, R218W, E220K, Magenta) werden bei 500 ns simuliert und die überlagerten Bilder werden angezeigt. Bei allen fünf pathogenen INF2-Varianten sind die Positionen von Glu968 bei 500 ns (Pfeilspitze, gelb) von der Referenzposition von WT (Pfeilspitze, rot) verschoben, was darauf hinweist, dass die pathogenen Varianten im Vergleich zu die veränderte Mobilität an der DID-DAD-Schnittstelle aufweisen die Wachtturm-Gesellschaft.

Anschließend untersuchten wir die Änderungen in der Dynamik des Restpaars an der DID-DAD-Schnittstelle. Wir verglichen zunächst die zeitliche Entwicklung des Abstands zwischen den Seitenketten der Rückgrat-Cα-Atome in Gly62 und Glu968 an der DID-DAD-Schnittstelle (ergänzende Abbildung S7). Die Abstände der Restpaare wurden während der 500-ns-Simulation verfolgt, die lang genug war, um eine stabile Konformation zu erreichen. Das Zeitentwicklungsdiagramm zeigte, dass pathogene Varianten hinsichtlich ihrer Flugbahn in drei Klassen eingeteilt werden: Eine Variante L69P zeigte den längsten durchschnittlichen Abstand zwischen Gly62 und Glu968 als der Wildtyp (1,32 vs. 0,67 nm, Ergänzungstabelle S4). die anderen beiden (G73D, E220K) wiesen im Vergleich zum Wildtyp einen gleichen oder kleineren Abstand auf (0,65 bzw. 0,52 nm). Die verbleibenden beiden T161N und R218W zeigten ein mittleres Entfernungsniveau, das im Laufe der Zeit schwankt (durchschnittlich 0,70 bzw. 0,73 nm).

Als nächstes verglichen wir die Variation der Restkontakte an der DID-DAD-Schnittstelle bei insgesamt 500 simulierten Strukturen, die alle 1 ns während der 500-ns-MD-Simulation zwischen der Wildtyp- und der INF2-Variante erfasst wurden, indem wir die Dissoziationsfrequenz maßen. Dissoziation ist definiert als der Abstand zwischen den Seitenketten von Gly62 und Glu968, der während der 500-ns-Simulation um mehr als 3–5 Å von der Referenzposition (bei 0 ns) abweicht. Die L69P-Variante zeigte die häufigste Dissoziation (77 % gegenüber 13 % beim Wildtyp), während G73D umgekehrt den niedrigsten Wert aufwies (0 %). T161N und R218W zeigten eine leicht bis mäßig höhere Dissoziationsrate (37 % bzw. 19 %) und E220K zeigte eine etwas geringere Häufigkeit (5 %) im Vergleich zum Wildtyp (13 %) (Ergänzende Abbildung S8, S9).

Insgesamt zeigen unsere MD-Simulationen der pathogenen Varianten variable Veränderungen im durchschnittlichen Abstand zwischen den Resten und deren Schwankungen an der DID-DAD-Schnittstelle des autoinhibitorischen Komplexes. Die Beobachtungen legen nahe, dass Mutationen native Restkontakte stören könnten, was zu einer insgesamt weniger stabilen Struktur führen könnte.

Als nächstes untersuchten wir die zellulären Auswirkungen von INF2-Varianten, indem wir die subzelluläre Verteilung von INF2-Proteinen und Aktinnetzwerken in HeLa- und COS-7-Zellen untersuchten, die mit cMyc-markierten INF2-Varianten transfiziert waren (ergänzende Abbildung S10). In HeLa-Zellen wies Wildtyp-INF2 eine diffuse Lokalisierung im gesamten Zytoplasma mit einem feinen retikulären, ER-lokalisierten Muster und einer perinukleären Golgi-Akkumulation auf8,21. Aktin-Stressfasern bildeten eine dicke parallele Anordnung, die die Zellen überspannte und der in nicht transfizierten Zellen ähnelte22,23.

Im Gegensatz dazu zeigten HeLa-Zellen, die CMT/FSGS-Varianten (G73D, V108D) exprimierten, eine veränderte subzelluläre INF2-Expression, die ungleichmäßig in einem grobkörnigen Muster verteilt war und weniger perinukleäre Golgi-Cluster aufwies (Abb. 7). Bemerkenswerterweise waren HeLa-Zellen, die CMT/FSGS-Varianten (G73D, V108D) exprimierten, gelegentlich entlang der Längsachse verlängert, was an Zellen erinnerte, die konstitutiv aktives mDia120 exprimierten. In diesen spindelförmigen Zellen sammelten sich einige INF2-Punkte am peripheren Pol an (Abb. 7). Die quantitative Analyse zeigte, dass Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimieren, im Vergleich zu Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimieren, deutlich weniger Aktin-Stressfaserfilamente aufweisen (Abb. 8). Transfizierte COS-7-Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimierten, zeigten ebenfalls eine abweichende subzelluläre INF2-Verteilung mit einer Golgi-Verteilung, die der von transfizierten HeLa-Zellen ähnelte, und zeigten gelegentlich eine deutliche Zellausbreitung (ergänzende Abbildung S11). Die Transfektion mit INF2 in Mauspodozyten zeigte eine subzelluläre Verteilung und ein Aktinnetzwerk, die im Wesentlichen denen von HeLa- und COS-7-Zellen ähnelten (ergänzende Abbildung S12).

Expression von INF2-Varianten, die entweder einzelne FSGS- oder duale CMT-FSGS-Phänotypen in HeLa-Zellen verursachen (A) Subzelluläre Lokalisierung von INF2-Varianten und Aktinnetzwerk. cMyc-markiertes Wildtyp-INF2 und pathogene Varianten wurden in HeLa-Zellen transfiziert. 8 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und mit Anti-cMyc-Antikörper (grün) und Phalloidin (weiß) gefärbt. Zwei Varianten (G73D, V108D) verursachen einen dualen CMT/FSGS-Phänotyp, während die anderen beiden (T161N, N202S) nur zu FSGS führen. Die Anzahl der Aktin-Stressfilamente war in Zellen, die die Variante G73D, V108D exprimierten, im Vergleich zu denen, die die Variante T161N, N202S exprimierten, deutlich reduziert. Gestrichelte Linien heben den Zellumriss hervor. Balken = 10 μm. (B) Western-Blot-Analyse von INF2-Varianten. Die INF2-Proteinexpression in HeLa-Zellen, die cMyc-markiertes Wildtyp-INF2 oder die Varianten G73D, V108D oder T161N und N202S exprimieren, wurde mittels Western Blot analysiert. FSGS-Variantenproteine ​​(T161N, N202S) waren weniger häufig als Wildtyp-Proteine. CMT/FSGS-Varianten (V108D, G73D) waren kaum nachweisbar, was darauf hindeutet, dass diese Variante möglicherweise anfälliger für eine Verschlechterung ist. Nach dem Stripping-Schritt wurde die interne Kontrolle von β-Tubulin auf der identischen Membran mit der gleichen Expositionszeit wie beim INF2-Nachweis (5 Minuten) erneut sondiert. Original-Blots/Gele sind in der ergänzenden Abbildung S14 dargestellt.

INF2-Varianten verändern Aktinnetzwerke in HeLa-Zellen, die Wildtyp- oder pathogene INF2-Varianten exprimieren. (A) Repräsentative Bilder von vier Untergruppen von Aktin-Stressfasermustern. Konfokale Bilder wurden gemäß vorheriger Studie22,23 unterteilt. Klasse 1: Schwere, ausgeprägte Kabel überqueren > 90 % des zentralen Bereichs der Zelle; Klasse 2: Mindestens zwei schwere, ausgeprägte Kabel dringen in die mittlere Hälfte der Zelle ein und der restliche Bereich ist mit dünnen Kabeln gefüllt; Klasse 3: Zellen haben nur feine Kabel; und Klasse 4: Im zentralen Bereich sind keine Kabel erkennbar. Maßstabsbalken: 10 µm. (B) Histogramm, das eine proportionale Verteilung der F-Actin-Phänotypen zeigt. Immunfluoreszenzbilder (n = 100) wurden visuell untersucht und von zwei unabhängigen Forschern bewertet. Die proportionalen Verteilungen der Aktin-Phänotyp-Kategorien unterschieden sich signifikant zwischen Wildtyp-INF2 (WT) und jeder Variante sowie zwischen FSGS- und CMT/FSGS-verursachenden Varianten-Untergruppen. Die Unterschiede zwischen den Untergruppen wurden durch den exakten Fisher-Test mit mehrfacher Testkorrektur analysiert: nicht signifikant (ns) oder signifikant (Sternchen).

HeLa-Zellen, die Varianten exprimieren, die nur mit FSGS assoziiert sind (T161N, N202S), behielten das diffuse ER-Muster mit Golgi-Akkumulation ähnlich wie Wildtyp-INF2 bei. Allerdings hatten diese Zellen weniger Aktin-Stressfasern als diejenigen, die Wildtyp-INF2 exprimierten, was darauf hindeutet, dass FSGS-Varianten eine Zytoskelett-Dysregulation aufweisen, die zwischen der bei Wildtyp- und CMT/FSGS-Varianten beobachteten liegt (Abb. 7, 8 und 9). Der Schweregrad der Aktin-Desorganisation in Zellen, die die FSGS-INF2-Variante exprimieren, wurde durch automatisierte Bildklassifizierung mit dem Deep-Learning-Tool ALEXNET weiter verifiziert. Nach dem Training des neuronalen Netzwerks anhand eines manuell beschrifteten repräsentativen Datensatzes (normale vs. weniger Kabel) wurden die Testbilder automatisch verarbeitet und in die beiden Kategorien klassifiziert. Zellen, die T161N exprimierten, wurden grundsätzlich in die Kategorie „Fasern mit weniger Stress“ eingeteilt, während diejenigen, die Wildtyp-INF2 exprimierten, insgesamt als ein normales Muster aufwiesend beurteilt wurden (p <0,001, ergänzende Abbildung S13).

Subzelluläre INF2-Lokalisierung und -Verteilung von Mitochondrien und Aktin in HeLa-Zellen, die Wildtyp- oder INF2-Varianten exprimieren. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion mit cMyc-markierten INF2-Konstrukten mit MitoTracker markiert und dann mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden dreifach mit c-Myc-Antikörper (Alexa 488), Phalloidin (Alexa 647) und MitoTracker (Alexa 555) gefärbt. Zellen, die die Wildtyp- und FSGS-Variante (T161N, N202S) exprimierten, zeigten ein diffuses, feines retikuläres ER-Muster mit Golgi-Clustern, wohingegen diejenigen, die die CMT-Variante (G73D, V108D) exprimierten, ein grobes punktförmiges Muster mit peripherer Ansammlung (Pfeile) zeigten. Die Verringerung der Anzahl der Aktin-Stressfasern war bei Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimierten, ausgeprägter als bei Zellen, die FSGS-Varianten exprimierten. In Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimierten, waren Mitochondrien gleichmäßig in der perinukleären Region verteilt. Im Gegensatz dazu verursachten alle pathogenen Varianten eine Fehllokalisation der Mitochondrien an der Zellperipherie (Pfeilspitzen). Das Ausmaß der Fehllokalisierung war bei Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimierten, schwerwiegender als bei Zellen, die FSGS-Varianten exprimierten. Zellen, die die T161N-Variante exprimierten, zeigten eine Zwischenkonfiguration mit einer nahezu gleichen Verteilung perinukleärer und peripherer Muster. Maßstabsbalken: 10 μm.

Die Western-Blot-Analyse von Lysaten aus HeLa-Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimieren, ergab eine einzelne Hauptbande mit einer scheinbaren Molekülmasse von 170 kDa. Die Proteine ​​waren bei den FSGS-verursachenden Varianten (T161N, N202S) weniger häufig als beim Wildtyp. Darüber hinaus waren in Zellen, die die mit CMT/FSGS assoziierten Varianten (G73D, V108D) exprimierten, die INF2-Proteinspiegel kaum nachweisbar, was darauf hindeutet, dass diese Variantenproteine, insbesondere des CMT/FSGS-Subtyps, labiler und daher anfälliger für den Abbau waren als wilde -Typ (Abb. 7B, ergänzende Abbildung S14). Zusammengenommen zeigten Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimierten, deutlichere Veränderungen in der Aktinorganisation, Zellform und Organellenanordnung (d. h. verändertes ER-Muster mit Golgi-Verteilung) als FSGS-Varianten, was wahrscheinlich auch die ausgeprägteren Defekte in ihrer subzellulären Verteilung widerspiegelt wie die Veränderungen in der Stabilität des INF2-Proteins.

Als nächstes untersuchten wir die Morphologie und Verteilung der Mitochondrien in fixierten HeLa-Zellen, die c-Myc-markiertes INF2 exprimieren. Zellen, die FSGS-Typ-Varianten (N202S) exprimierten, hatten Mitochondrien, die größtenteils in der perinukleären Region verteilt waren, und zwar in einem ähnlichen Muster wie bei Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimierten (Abb. 9). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die CMT/FSGS-Varianten (G73D und V108D) exprimierten, eine deutliche Veränderung der Mitochondrienverteilung mit einer Tendenz zur peripheren Lokalisierung mit longitudinaler, paralleler Ausrichtung einiger Mitochondrien entlang der desorganisierten Aktinfilamente (Abb. 9). Zellen, die die T161N-Variante exprimierten, zeigten hinsichtlich Form und subzellulärer Verteilung einen intermediären Phänotyp, bei dem Mitochondrien überwiegend perinukleär lokalisiert waren und an der Zellperipherie eine gewisse aberrante Anreicherung aufwiesen (Abb. 9).

Als nächstes untersuchten wir die Morphologie der Mitochondrien in lebenden Zellen, die mit INF2-Varianten transfiziert wurden, wobei wir die T161N-Variante als repräsentative pathogene Variante verwendeten und das Mitochondriennetzwerk in lebenden Zellen mit MitoTracker markierten. In Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimierten, hatten Mitochondrien ein normales tubuläres Muster mit perinukleärer Ansammlung. Im Gegensatz dazu veränderte die Expression von T161N-Varianten die mitochondriale Morphologie vom normalen röhrenförmigen Muster in ein kugelförmiges Muster mit fragmentiertem Erscheinungsbild (Abb. 10, ergänzende Abbildung S15, 16). Darüber hinaus waren einige Mitochondrien an der Zellperipherie abweichend verteilt (Abb. 9, 11). Die quantitative Analyse ergab, dass die durchschnittliche Mitochondrienlänge in T161N-exprimierenden Zellen im Vergleich zum Wildtyp um den Faktor 2,76 abnahm, was darauf hindeutet, dass diese pathogene Variante die Mitochondrienfragmentierung erhöht (Abb. 10, ergänzende Abbildung S15, 16). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die INF2-T161N-Variante die Größe, Form und Verteilung der Mitochondrien durch Desorganisation des Zytoskeletts verändert.

Morphologie der Mitochondrien in HeLa-Zellen, die entweder die Wildtyp- oder die T161N-INF2-Variante exprimieren. (A) Mitochondrienmorphologie in lebenden Zellen. Die Zellen wurden 8 Stunden nach der Transfektion mit GFP-markiertem Wildtyp-INF2 oder der T161N-Variante mit MitoTracker markiert. Die Bilder wurden mit Filtern bei 488 nm (GFP, grün) und 555 nm (MitoTracker, rot) aufgenommen. Mitochondrien waren in Zellen, die die T161N-Variante exprimierten (Pfeilspitzen), stärker fragmentiert und zeigten im Vergleich zu Zellen, die den Wildtyp exprimierten (Pfeile), ein größtenteils röhrenförmiges Muster. Sternchen weisen auf eine Fehlverteilung an der Zellperipherie hin. Maßstabsbalken: 5 µm. (B) Quantifizierung der mitochondrialen Länge. Die Länge von 10 Mitochondrien pro zufällig ausgewähltem Bereich im Zytoplasma wurde mit ImageJ gemessen (n = 20 Bereiche für jede Gruppe). Zellen, die die T161N-INF2-Variante exprimierten, wiesen eine 2,76-fache Verringerung der Mitochondrienlänge auf. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. (C) Quantifizierung der Mitochondrienzahl pro Zelle. Die Anzahl der Mitochondrien wurde mit dem Count and Measure-Tool des Cellsens-Programms analysiert (n = 15 Zellen für jede Gruppe). Zellen, die die T161N-INF2-Variante exprimierten, wiesen eine deutlich höhere Anzahl an Mitochondrien auf als Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimierten. Die Anzahl der Mitochondrien in den Wildtyp-transfizierten und nicht transfizierten Kontrollzellen unterschied sich nicht signifikant (p = 0,06). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt.

Morphologie und Verteilung der Mitochondrien in COS-7-Zellen, die entweder die Wildtyp- oder die T161N-INF2-Variante exprimieren. (A) Veränderungen in Mitochondrien in INF2-exprimierenden Zellen. Mit cMyc markiertes Wildtyp-INF2 oder die T161N-Variante wurden in COS-7-Zellen transfiziert, die 8 Stunden nach der Transfektion fixiert und mit Anti-c-Myc-Antikörper (grün) und MitoTracker (rot) markiert wurden. Zellen, die die T161N-Variante exprimierten, zeigten eine häufigere Fragmentierung und Fehlverteilung der Mitochondrien an der Zellperipherie (Pfeile); In Zellfortsätzen wurde eine gewisse Anreicherung beobachtet (Pfeilspitzen). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimierten, tubuläre Strukturen, die sich bevorzugt in der perinukleären Region ansammelten. Gestrichelte Linien zeigen die Umrisse nicht transfizierter Zellen an. Maßstabsbalken: 10 μm. (B) Geometrische Profilierung der Mitochondrienverteilung in INF2-exprimierenden Zellen. Die Intensitätsprofile der Mitochondrien entlang der in Tafel A gekennzeichneten weißen Linien wurden mit ImageJ aufgezeichnet. Die Y-Achse repräsentiert die Intensität der mitochondrialen Signale (Grauwert), während die X- und Z-Achse die Zellachse bzw. die Ausbreitung darstellen. Die durch die weiße gepunktete Linie markierten Bereiche wurden analysiert. Zellen, die Varianten vom CMT/FSGS-Typ (G73D) exprimieren, zeigten eine deutliche periphere Fehlverteilung der Mitochondrien; Das Fehlen von Signalen im zentralen Bereich wird durch das Sternchen angezeigt. Zellen, die T161N-Varianten exprimierten, zeigten ein intermediäres Fehlverteilungsmuster, bei dem sowohl eine normale perinukleäre Lokalisierung als auch gelegentliche Fehlverteilungen in die Zellperipherie vorhanden waren.

Als nächstes verglichen wir die Mikrotubuli-Anordnung von HeLa-Zellen, die N-terminales GFP-markiertes Wildtyp-INF2 und pathogene Varianten exprimieren. In nicht transfizierten Zellen und solchen, die Wildtyp-INF2 exprimieren, erzeugten Mikrotubuli eine radiale Anordnung, die sich gleichmäßig über das Zytoplasma verteilte (Klasse 1, in Abb. 12). Dieses Muster deutet auf eine normale Keimbildung und Polymerisation von einem perinukleären Mikrotubuli-Organisationszentrum hin. Unterdessen zeigten Zellen, die pathogene INF2-Varianten exprimierten, ein desorganisiertes Mikrotubuli-Netzwerk. Zellen, die die T161N-Variante exprimierten, zeigten ein ungleichmäßiges, gemischtes Muster der Mikrotubuli-Desorganisation, bei dem der Kortex mit in Längsrichtung ausgerichteten, dicken Mikrotubuli-Bündeln und einer spärlichen Verteilung normaler dünner, strahlender Mikrotubuli-Anordnungen gefüllt war (Klasse 2). Zellen, die die G73D-Variante exprimieren, zeigten typischerweise eine globale Dysregulation, bei der die meisten Mikrotubuli als parallel zur Zelllängsachse ausgerichtete Bündel desorganisiert waren und keine Polarität hatten (Klasse 3).

Mikrotubuli-Anordnung und Mitochondrienverteilung in HeLa-Zellen, die INF2-Varianten exprimieren. Mit eGFP-markierten Wildtyp-INF2-, T161N- und G73D-Varianten transfizierte HeLa-Zellen wurden mit MitoTracker (rot) und Anti-α-Tubulin (weiß) gefärbt. Der Umriss der transfizierten Zellen ist durch gepunktete Linien dargestellt. (A) Subzelluläre Verteilung von Mitochondrien und Mikrotubuli. Mitochondrien in Zellen, die die T161N-Variante (Pfeilspitze) exprimierten, waren in der Zellperipherie falsch verteilt, während sich die Mitochondrien in Wildtyp-Zellen überwiegend in der perinukleären Region befanden. In Zellen, die Wildtyp-INF2 exprimierten, waren Mikrotubuli in einem diffusen, strahlenden Muster organisiert. Zellen, die T161N- und G73D-Varianten exprimierten, wiesen unterschiedliche Grade an aberranter Ausrichtung auf und wiesen insbesondere parallele Bündel auf. Balken = 20 μm. (B) Die drei Subtypen werden nach den folgenden Kriterien klassifiziert: Klasse 1: normaler Subtyp: in einer Reihe ausgerichtet, die vom Zentrosomenbereich in der Nähe der Kerne ausgeht (normaler Subtyp). Der Pfeil zeigt das Organisationszentrum der Mikrotubuli an. Klasse 2: Zwischensubtyp: Einige Regionen des Zytoplasmas sind von parallel angeordneten Mikrotubuli besetzt, während der verbleibende Bereich mit einer normal strahlenden Anordnung gefüllt ist; und Klasse 3: desorganisierter Subtyp: Mikrotubuli sind global parallel ausgerichtet (Bündelbildung) entlang der Längsachse der Zellen. Das Diagramm zeigt eine proportionale Verteilung dieser Phänotypen in HeLa-Zellen. Zellen aus drei unabhängigen Transfektionen wurden klassifiziert (n = 200 Zellen).

Die Doppelmarkierung von Mitochondrien zeigte, dass die Mitochondrien in Zellen, die die G73D- oder T161N-INF2-Variante exprimierten, im scharfen Gegensatz zur vorherrschenden perinukleären Lokalisierung, die in nicht transfizierten und Wildtyp-INF2-exprimierenden Zellen beobachtet wurde, Mitochondrien aufwiesen, die in der Zellperipherie falsch verteilt waren, was auf einen Defekt hindeutet Mitochondrientransport entlang von Mikrotubuli.

Die quantitative Klassifizierung der morphologischen Muster in drei Untergruppen ergab, dass etwa 70 % sowohl der Wildtyp- als auch der nicht transfizierten Zellen zufällig strahlende Mikrotubuli aufwiesen (Klasse 1). Im Gegensatz dazu zeigten etwa 60 % der Zellen, die die T161N-Variante exprimierten, ein teilweise desorganisiertes Mikrotubulimuster (Klasse 2), während etwa 70 % der Zellen, die die G73D-Variante exprimierten, eine globale Mikrotubuli-Unordnung aufwiesen (Klasse 3, n = 200 Zellen für jede Gruppe) ( Abb. 12). Die Beobachtungen zeigten, dass pathogene INF2-Varianten eine desorganisierte Mikrotubuli-Architektur und mitochondriale Verteilung förderten und die CMT/FSGS-Varianten eine schwerwiegendere Desorganisation verursachen als die FSGS-Varianten.

In der vorliegenden Studie haben wir die molekularen Mechanismen untersucht, durch die INF2-DID-Mutationen zwischen den Resten 57 und 184 zwei Untergruppen von Störungen verursachen, CMT und FSGS. Strukturmodellierung und Molekulardynamiksimulation ergaben keine konsistenten Unterschiede zwischen den Varianten, die mit den beiden unterschiedlichen Phänotypen verbunden sind. Unsere Expressionsstudien ergaben, dass sowohl CMT/FSGS- als auch FSGS-Varianten eine gemeinsame Wirkungsweise haben, die sich hauptsächlich auf die Aktin-Mikrotubuli-Organisation auswirkt. Eine solche Desorganisation des Zytoskeletts stört globale Zelleigenschaften wie die Form und Position von Organellen. Mit CMT/FSGS assoziierte Varianten haben eine stärkere Wirkung auf das Zytoskelett als Varianten, die nur mit FSGS assoziiert sind, und führen daher wiederum zu schwerwiegenderen Mitochondriendefekten. Insbesondere mitochondriale Defekte sind eine kritische Folge der Zytoskelett-Dysregulation bei INF2-Erkrankungen, da solche Anomalien häufig bei anderen klinischen Subtypen der CMT sowie bei FSGS beobachtet werden2,3,19. Die Positionen unserer INF2-Mutationen stimmen mit den gemeldeten Hotspots überein, bei denen sich einzelne FSGS-verursachende Varianten in der distalen Hälfte der DIS befinden, während sich diejenigen für den dualen CMT/FSGS-Phänotyp in der proximalen N-terminalen Hälfte der DIS verteilen. Aktuelle Mutationskataloge haben jedoch keinen konsistenten Unterschied in der Lokalisation zwischen den beiden klinischen Subtypen ergeben (Ergänzungstabelle S5, S6). Beispielsweise gibt es erhebliche intra- und/oder interfamiliäre Variabilität der INF2-Mutationen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Patienten mit INF2-Varianten, die die proximale DID-Domäne betreffen (Rest Arg91, Val102, Cys104), nur CMT oder CMT mit minimaler Glomerulopathie aufwiesen19 (Ergänzungstabelle S6). Daher sind Nierenerkrankungen bei den meisten INF2-Erkrankungen ein gemeinsamer Nenner des klinischen Phänotyps. Es sind jedoch weitere Genotyp-Phänotyp-Korrelationsstudien erforderlich, um die Hypothese zu bestätigen, dass Podozyten möglicherweise anfälliger für INF2-induzierte Zytoskelett-Aberrationen sind als Neuronen9,19. In unserer Studienkohorte zeigten Patienten mit dem dualen CMT/FSGS-Phänotyp die beiden Krankheiten nahezu gleichzeitig und entwickelten viel schneller eine terminale Niereninsuffizienz als Patienten mit FSGS allein24. Diese klinischen Beobachtungen legen nahe, dass Patienten mit dualer CMT/FSGS unter schwerwiegenderen, globalen Zellschäden leiden, die, wie bei Patienten mit FSGS, wahrscheinlich auf einen gemeinsamen Mechanismus zurückzuführen sind, der sich hauptsächlich auf die Organisation des Zytoskeletts auswirkt. In Übereinstimmung mit dieser Möglichkeit bestätigten die Ergebnisse von Expressionsstudien, dass Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimieren, im Vergleich zu FSGS-INF2-Varianten tatsächlich eine ausgeprägtere Störung des Zytoskeletts und eine stärkere Organellenstörung aufwiesen und dass die mit der CMT/FSGS-Variante verbundene Störung den kritischen Schwellenwert für die Auslösung einer Krankheit überschreiten würde sowohl in Schwann-Zellen als auch in Podozyten (Abb. 13). Für die INF2-Varianten wurde jedoch über eine beträchtliche phänotypische Vielfalt berichtet. Weitere Untersuchungen mit einer größeren Mutationsuntersuchung sind erforderlich, um die Genotyp-Phänotyp-Korrelation zu verstehen.

Hypothetisches Modell pathogener Mechanismen, die einem Spektrum von INF2-Störungen zugrunde liegen. (A) Standorte von INF2-Mutationen und klinische Phänotypen. Zwei INF2-Krankheitsphänotypen, duales CMT/FSGS oder einzelnes FSGS, sind mit INF2-Mutationen verbunden, die sich in bestimmte Regionen der DIS segregieren. CMT/FSGS-Varianten häufen sich in den Resten 57 bis 184 des DID, wohingegen sich FSGS-Varianten meist in den Resten 184 bis 245 des DID befinden. Degenerierte Schwann-Zellen produzieren eine dünne Myelinscheide (myelinisierendes Neuron) und/oder überzählige Vorsprünge (nicht myelinisierendes Neuron). Degenerierte Podozyten lösen sich von der Basalmembran. (B) Vorgeschlagenes Modell für die Krankheitspathogenese. INF2-Mutationen stören in erster Linie die Aktin- und Mikrotubuli-Organisation, was anschließend zu einer umfassenderen zellulären Dysfunktion einschließlich fehlerhafter mitochondrialer Morphologie und Vesikeltransport führt. Die Mutationseffekte werden mit zunehmendem Alter schwerwiegender und spiegeln eine allmähliche Anhäufung subtiler Schäden wider. Wenn die Zellschädigung eine kritische Schwelle erreicht, kommt es zum Zelltod und Krankheitsphänotypen beginnen sich klinisch zu manifestieren. Unsere Expressionsstudie zeigt, dass CMT/FSGS-Varianten hinsichtlich der Desorganisation des Zytoskeletts und der Organellen schädlichere Auswirkungen haben als FSGS-Varianten. Basierend auf (1) nur wenigen INF2-Mutationen, die allein CMT verursachen, und (2) der Tatsache, dass FSGS normalerweise schwerwiegend ist, wenn CMT-Phänotypen gleichzeitig vorliegen, ist es plausibel, dass Podozyten anfälliger für durch INF2-Mutationen verursachte Schäden sind als Schwann-Zellen Dies stützt die Hypothese einer niedrigeren pathogenen Schwelle für FSGS als für CMT. Allerdings zeigten 3 von 30 gemeldeten Fällen mit CMT/FSGS-Varianten einen vorherrschenden CMT-Phänotyp (CMT allein oder mit minimaler Glomerulopathie). Eine größere Mutationsstudie ist zwingend erforderlich, um unsere Hypothese zu überprüfen, dass die pathogene Schwelle von CMT (Sternchen) im Allgemeinen die von FSGS überschreiten kann. DID, Diaphanous inhibitorische Domäne; DAD, Diaphanous autoregulatory domain; FSGS, Fokale segmentale Glomerulosklerose; CMT, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit.

Die Strukturmodellierung ergab, dass die INF2-Mutationen, die CMT/FSGS verursachen, ausschließlich in der konkaven Tasche des DID lokalisiert waren, die die DAD-Bindungsschnittstelle bildet und für die Selbstinhibition von entscheidender Bedeutung ist5,8,9. Unsere Strukturstudien bestätigten, dass die INF2-DID-Mutationen die DID-DAD-Wechselwirkungen beeinträchtigen könnten. Erstens zeigte die Strukturmodellierung pathogener INF2-Varianten Veränderungen in den Aminosäurepaarungen und der Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen, die zwei Schlüsselelemente für die DID-DAD-Wechselwirkung sind. Unsere Schätzung der freien Energie ergab jedoch im Einklang mit früheren Studien keinen beobachtbaren Unterschied zwischen CMT/FSGS- und FSGS-Varianten19. Zweitens zeigten unsere Molekulardynamiksimulationen unter der Annahme einer wässrigen Lösung, dass alle pathogenen INF2-Mutationen die Flexibilität und Stabilität des DID-DAD-Komplexes verändern könnten. Wir fanden heraus, dass die Mutationen laut RMSD-Analyse die allgemeine Strukturstabilität beeinflussen und laut RMSF-Analyse variable Änderungen in der Restdynamik verursachen. Um den Einfluss der Mutationen auf die Proteindynamik genau abzuschätzen, haben wir die MD-Analyse über einen angemessenen Zeitraum (500 ns) durchgeführt. Solche MD-Simulationen sind lang genug, damit das Protein den Konformationsraum erkunden und sich für den stabilsten entscheiden kann. Dies ermöglichte eine genaue Abschätzung der Aminosäurewechselwirkungen, z. B. der Veränderungen der Seitenkettenwechselwirkung im Laufe der Zeit (Ergänzende Abbildungen S6, 7, 8, 9).

Die MD-Analyse ergab eine Variation in der Flexibilität der interagierenden Rückstände zwischen den pathogenen Varianten. Unsere RMSD- und RMSF-Analysen ergaben einen Trend, dass CMT/FSGS-Varianten im Vergleich zu den anderen INF2-Varianten stärkere Veränderungen in der Flexibilität des DID-DAD-Komplexes verursachen können (Abb. 4, 5 und 6, ergänzende Abbildung S6–S9). Wir konnten jedoch keine konsistenten MD-Trends finden, die den Unterschied im phänotypischen Schweregrad zwischen schwerer dualer CMT/FSGS und leichter einzelner FSGS-Erkrankung erklären könnten. Dies ist zum Teil auch auf die begrenzte Anzahl analysierter Varianten und die Variabilität der strukturellen Auswirkungen von Mutationen zurückzuführen. Insbesondere können einige lokale Restfluktuationen die Konformation von Bindungstaschen direkt beeinflussen, während andere sekundär die Größe und Krümmung der DAD-Erkennungsoberfläche und ihrer Nachbarn beeinflussen können. Beispielsweise könnte entweder eine Zunahme (destabilisiert) oder eine Abnahme (überstabilisiert) der Restflexibilität der DID-Domäne die lokale DID-DAD-Wechselwirkung sterisch behindern und dadurch die Bindungsaffinität und/oder Häufigkeit der DID-DAD-Schnittstellen beeinflussen25.

Wir fanden einen bemerkenswert hohen RMSF für die drei obersten Cluster in den DAD-Bindungsregionen des DID in Wildtyp-INF2 bei den Resten 80–96, 152–164 und 180–194. Jede Region entspricht den flexiblen Schleifenstrukturen, die α-Helices in den DID-Bindungstaschen verbinden und mit den zentralen Helices (α7, α10 und α13) aus den zweiten, dritten und vierten Gürteltierwiederholungen zusammengesetzt sind (Ergänzende Abbildung S3, S6)16,25. Diese fluktuierenden Loci befinden sich in der Nähe der interagierenden Reste 107–115, 146–152 und 203–206, von denen vorhergesagt wird, dass sie die DAD-interagierende Tasche 16,25 bilden. Die durch Armadillo-Wiederholungen gebildeten superhelikalen Strukturen bestimmen die Krümmung des Proteins, das für die Peptidbindung geeignet ist. Zahlreiche Studien zeigen, dass durch DID-α-Helices gebildete Gürteltierwiederholungen diesen Proteinen ermöglichen, verschiedene Interaktionspartner und Funktionen in der Zelle zu haben, und dass sie im gesamten Eukaryotenreich konserviert sind16,25. Unsere und andere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DID-Mutationen das native Interaktionsmuster benachbarter Reste in der Nähe von Mutationen verändern und dadurch die Proteinstabilität und Flexibilität des autoinhibitorischen DID-DAD-Komplexes beeinträchtigen könnten. Weitere MD-Simulationen, z. B. RMSF-Bestimmung unter Einbeziehung pathogenerer Varianten und Vergleich mit gutartigen Varianten, werden dabei helfen zu verstehen, welche einzelnen Reste eine Schlüsselrolle bei den Strukturschwankungen des Proteinkomplexes spielen könnten.

Wir wollten herausfinden, wie CMT/FSGS-Varianten biologisch schädlicher sein könnten als FSGS-Varianten. Die Transfektionsprotokolle für INF2-Varianten wurden optimiert, um die Zytotoxizität durch parallele Überwachung des zellulären Phänotyps geeigneter Kontrollen zu minimieren. Wir verglichen die zellulären Auswirkungen von INF2-Varianten unter den Bedingungen, unter denen mit einem Scheinvektor oder Wildtyp-INF2-cDNA transfizierte Zellen (plus die umgebenden nicht transfizierten Zellen) keine schädlichen Veränderungen in der Aktin-Mikrotubuli-Organisation und der Organelleninteraktion zeigten (Ergänzende Abbildung S10). ). Die schädlichen Auswirkungen der CMT/FSGS-Varianten könnten auf ihre verringerte INF2-Dosierung zurückzuführen sein, wie die Ergebnisse des Western Blots nahelegen, die zeigen, dass die Proteinspiegel bei den CMT/FSGS-Varianten im Vergleich zum Wildtyp verringert waren. Eine solche Spurenmenge der CMT/FSGS-Varianten könnte sogar Krankheiten auslösen10.

Alternativ könnten CMT/FSGS-Varianten, die die Reste 57 bis 184 von DID beeinflussen, bereits bestehende molekulare Interaktionen oder Signalwege beeinträchtigen, die für neuronale Gewebe spezifisch sind10. Beispielsweise können CMT/FSGS-Varianten bevorzugt die akute Zellanpassung als Reaktion auf Stress beeinträchtigen10. Frühere Studien zeigten, dass INF2 tatsächlich an der Umgestaltung der Aktinarchitektur während der Gewebereparatur nach einer Verletzung beteiligt ist10,11. INF2-Mutationen, die CMT/FSGS verursachen, können daher das betroffene Gewebe aufgrund von Verzögerungen bei den Reparaturprozessen, die zur Wiederherstellung nach einer Verletzung erforderlich sind, anfälliger für Verletzungen machen. Frühere Studien zeigten, dass pathogene INF2-Varianten kalziuminduzierte, vorübergehende Aktinausbrüche in lebenden Zellen störten und langjährige, durch den Serumreaktionsfaktor regulierte Transkriptome verändern könnten, die wiederum andere Zellfunktionen außerhalb des Zytoskeletts dysregulieren11,26. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um das Gewebe zu definieren -spezifische Mediatoren, die in Podozyten und/oder Schwann-Zellen wirken9.

Wir fanden heraus, dass das Ausmaß der Störung des Mikrotubuli-Netzwerks proportional zum Schweregrad der Aktin-Desorganisation ist. Es ist bekannt, dass INF2 Mikrotubuli kolokalisiert, direkt bindet und sowohl die Bündelung als auch die Stabilisierung vermittelt27,28,29. Daher sind zwei Mechanismen für die schädlichen Auswirkungen von FSGS/CMT-Varianten plausibel: INF2-Mutationen könnten Mikrotubuli-Netzwerke durch direkte Auswirkungen auf Mikrotubuli desorganisieren und/oder indirekte Folgen haben, die sich aus veränderten Aktin-Mikrotubuli-Wechselwirkungen ergeben. Hier fanden wir heraus, dass HeLa-Zellen, die pathogene INF2-Varianten exprimieren, dazu neigen, spindelförmige Zellformen mit bipolarer Verlängerung (Abb. 7, 9) sowie eine ungewöhnliche parallele Anordnung von Mikrotubuli aufzuweisen. Diese Zellmerkmale erinnern an Zellen, die konstitutiv aktive mDia1-Varianten14,20 exprimieren, bei denen Veränderungen in Mikrotubuli hauptsächlich die Zellverlängerung vorantreiben. Im Gegensatz dazu zeigten frühere Studien mit INF2-Knockout-Zellen, dass INF2 eine Schlüsselrolle bei der Lamellipodienbildung der Zellrinde spielt30. Da eine Reihe von Mikrotubuli-Interaktionen mit aktinbasierten Strukturen in der Zellrinde für die Stabilisierung von Mikrotubuli unerlässlich sind27,29, spekulieren wir, dass in Zellen, die INF2-Varianten exprimieren, Mikrotubuli, die zum Einfangen von kortikalem Aktin benötigt werden, defekt sein könnten. Zu den Mechanismen gehört wahrscheinlich das Verschließen von schneller wachsenden Plus-End-Mikrotubuli durch Interaktion mit verschiedenen Forminen und anderen „Stabilisomen“-Proteinen, die Plus-End-Tracking-Proteine ​​und Gerüstelemente (z. B. IQGAP1) umfassen 19,27,28,29,30,31 .

Angesichts des großen Überschusses an Aktinmonomeren (~ 100 μM) im Vergleich zu Regulatoren (0,05–4,21 μM) müssen Zellen über eine strenge räumlich-zeitliche Regulierung der Aktinassemblierung verfügen, um die Zellpolarität und -form aufrechtzuerhalten, insbesondere während der aktiven Proliferation und Differenzierung32. Aus diesem Grund muss die INF2-Aktivierung auf bestimmte Regionen beschränkt werden, normalerweise auf die Zellrinde6. Hier zeigten wir, dass Zellen, die pathogene INF2-Varianten exprimieren, verringerte Mengen an Aktin-Stressfasern und kortikalem Aktin aufwiesen, was mit früheren Berichten übereinstimmt8,9. Bemerkenswerterweise war die Aktin-Desorganisation in Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimierten, morphologisch stärker ausgeprägt als in FSGS-Varianten, was auch mit der vorherigen Studie übereinstimmt10. Der Grad der Störungen des Zytoskeletts, die durch die pathogenen INF2-Varianten in unserer Immunzytochemie mit festen Zellen verursacht wurden, korrelierte mit der Schwere der fehlerhaften Ca2+-induzierten Aktin-Reorganisation (Ca-AR), die in lebenden HeLa-Zellen berichtet wurde10,26. Wir sahen jedoch keine merklichen Veränderungen in den Filopodien in unseren fixierten Zellen, die INF2-Varianten exprimierten, was im Gegensatz zu früheren Beobachtungen steht, die darauf hindeuteten, dass konstitutiv aktive INF2-Proteine ​​die Länge der Filopodien erhöhen10,14. Unsere Daten deuten zusammen mit denen anderer Forscher darauf hin, dass CMT/FSGS-Varianten mit einer ausgeprägteren Desorganisation von Aktinnetzwerken verbunden sind als FSGS-Varianten. Die Bildgebung lebender Zellen wird helfen zu klären, wie INF2-Mutationen die Aktin-Remodelling-Dynamik beeinflussen.

Die verminderten Aktinkabel/-bündel in HeLa-Zellen, die INF2-Varianten exprimieren, stehen im Einklang mit einigen früheren Studien8,9, stehen jedoch im Widerspruch zu anderen Studien, die erhöhte Aktinfilamente im ER und/oder Zytoplasma von aus Osteosarkomen stammenden U2OS-Zellen zeigten12,17. Die histologische Analyse biopsierter Suralisnerven von Patienten mit CMT/FSGS im Zusammenhang mit INF2-Mutationen ergab, dass nicht myelinisierende Zellen filopodienartige überzählige Vorsprünge mit abnormaler Aktinakkumulation im Zytoplasma produzieren, was auf das Vorliegen einer globalen Aktinopathie schließen lässt. INF2 hat die einzigartige Fähigkeit, sowohl die Polymerisation als auch die Depolymerisation von Aktin zu fördern7,12,17,21,33 (Ergänzende Abbildung S17). Mehrere In-vitro-Studien mit biochemischen Tests sowie Zelltransfektion zeigten, dass pathogene INF2-Varianten funktionell konstitutiv aktiv sind7,10,12,14,17,31. Der Nettoeffekt dieser konstitutiven Aktivierung auf die lokale Aktinassemblierung ist jedoch unklar. Wir schlagen mehrere Erklärungen für die Unterschiede zwischen unseren Ergebnissen und früheren Ergebnissen vor. Erstens kann die Regulierung der INF2-Aktivität durch Autoinhibition in vivo von der in vitro berichteten abweichen. Biochemische In-vitro-Studien zeigten, dass im Gegensatz zu anderen Forminen die Bindung von G-Aktin an die WH2-DAD-Domäne die INF2-Autoinhibition lindert und die Aktinpolymerisation aktiviert17,21. Im Gegensatz dazu kann die INF2-Autoinhibitionsaktivität in vivo durch lokale zelluläre Aktinmonomerkonzentrationen verändert werden29. Bei niedrigeren Konzentrationen von Aktinmonomeren als physiologische Werte hemmen INF2-DID-DAD-Wechselwirkungen die Polymerisation, bei höheren Konzentrationen gibt es jedoch keine Hemmung17,29. Die Konzentrationen von G-Actin-Monomeren innerhalb der Zelle können sich dynamisch ändern (im Bereich von 1–100 μM), als Reaktion auf Cofaktoren (z. B. Actin-Monomer-Sequestrierungsproteine ​​wie Profilin und Thymosin β4), Capping-Proteine ​​und Actin-Acetylierung7,27,32. Die hohe Affinität von INF2 WH2-DAD für G-Actin ermöglicht es ihm, als Sensor für subtile physiologische Schwankungen der zytosolischen G-Actin-Spiegel zu dienen und die Aktinpolymerisation als Reaktion auf das zelluläre Milieu fein abzustimmen27. Darüber hinaus können zelluläre INF2-Inhibitoren wie CAP1 und CAP27,17 sowie der lokale Bedarf an morphologischen Anpassungen auch die Aktin-Keimbildung und -Verlängerung verändern34.

Zweitens würde die INF2-Aktivität kurze und vorübergehende Aktinfilamente erzeugen33. In vitro depolymerisiert INF2 Aktinfilamente biochemisch schnell, aber ob eine ähnliche Aktivität in vivo auftritt, wo INF2 im Vergleich zu Aktin reichlich vorhanden ist, ist unklar12,17. Die trennende/depolymerisierende Aktivität von INF2 könnte als Reaktion auf den Aktin-Ausbruch aktiviert werden.

Drittens kann die durch INF2-Varianten verursachte Aktin-Desorganisation durch fehlerhafte heteromere Wechselwirkungen verändert werden. INF2-DID-Varianten beeinflussen nicht nur das Polymerisations-/Depolymerisationsgleichgewicht von Aktin,33 sondern auch die Wechselwirkung mit interagierenden Partnern, einschließlich Mitgliedern der Rho-Familie kleiner GTPasen9,19 (Ergänzende Abbildung S18). Interformin-Wechselwirkungen sind ebenfalls wichtig: mDia-DAD konkurriert mit Aktinmonomeren um die INF2-DID-Bindung in trans11,29 und reguliert dadurch die mDia-Aktivität negativ. Somit könnten pathogene INF2-DID-Varianten die normale Herunterregulierung durch Rho-mDia verringern und wiederum die mDia-vermittelte Aktinpolymerisation fördern11.

Mitochondriale Anomalien können erhebliche Auswirkungen auf die phänotypische Variabilität sowie den Schweregrad von INF2-Störungen haben. Hier fanden wir eine übertriebene Fragmentierung und periphere Fehlverteilung der Mitochondrien in Zellen, die INF2-Varianten exprimieren. Bemerkenswerterweise waren diese Mitochondriendefekte in Zellen, die CMT/FSGS-Varianten exprimierten, stärker ausgeprägt als in Zellen, die FSGS-Varianten exprimierten, und die Schwere der mitochondrialen Veränderungen korrelierte mit dem Grad der Desorganisation des Zytoskeletts. Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass die mitochondrialen Defekte wahrscheinlich das dysregulierte Aktin-Mikrotubuli-Netzwerk widerspiegeln. In Zellen, die INF2-Varianten exprimierten, neigten die Mitochondrien dazu, sich in Richtung der Zellperipherie zu verschieben, und einige Mitochondrien richteten sich parallel zu desorganisierten Mikrotubuli aus. Die durch INF2-Varianten induzierte mitochondriale Fehlverteilung kann auf eine Funktionsstörung der Mikrotubuli zurückzuführen sein. Mikrotubuli leiten den Transport von Mitochondrien zu bestimmten subzellulären Bereichen wie zellulären Prozessen von Neuronen und Podozyten35. Darüber hinaus haben Mikrotubuli-Netzwerke eine globale Funktion, die den Golgi-Komplex in der Nähe des Zentrosoms positioniert und das ER bis zum Rand der Zellen ausbreitet36. Eine fehlerhafte Mitochondrien-Fusionsspaltung an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen kann auch den Mitochondrien-Handel und die Anbindung beeinträchtigen.

Alternativ können Veränderungen in der Mitochondrienverteilung mit einer intrinsischen Eigenschaft von INF2-Varianten verbunden sein, die ihre Wechselwirkungen im ER und in den Mitochondrien stört. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen unserer Expressionsstudie erhöht die Expression der konstitutiv aktiven INF2-A149D-Variante in HeLa-Zellen die Mitochondrienspaltung und reduziert gleichzeitig die Zellmobilität und Fusionsereignisse, wie in einer früheren Studie mit U2OS-Zellen beobachtet wurde12,17. Mitochondrien unterliegen einer kontinuierlichen Fusion und Spaltung, deren Gleichgewicht ihre Morphologie bestimmt. INF2 spielt eine unterstützende Rolle bei der Mitochondrienspaltung, möglicherweise indem es die anfängliche Verengung der Mitochondrien vorantreibt, was die durch Drp1 gesteuerte sekundäre Verengung erleichtert 12. Die Regulierung der Mitochondriendynamik dient auch verschiedenen Zellfunktionen, einschließlich Mitochondrienmotilität und -transport sowie Interaktionen mit anderen Organellen wie dem ER37,38. Bis zu 20 % der mitochondrialen Oberfläche liegen eng an den ER-Membranen an. Diese Schnittstelle fungiert als entscheidender Knotenpunkt für die Kalziumsignalisierung, Apoptose, Autophagie und Lipidbiosynthese und ist daher eng mit dem Leben und Tod von Zellen verbunden 37.

Podozyten und periphere Nerven haben im Vergleich zu anderen Zelltypen einen höheren Energiebedarf und müssen daher die Dynamik und Verteilung der Mitochondrien entlang ihrer hochspezialisierten langen und/oder multiplen Prozesse aufrechterhalten. Wichtig ist, dass Mutationen in Genen, die an der Mitochondrienspaltung beteiligt sind (z. B. MFN2, OPA1 und GDAP1), eine Hauptursache für CMT39,40 sind (Ergänzungstabelle S7). In ähnlicher Weise wie INF2 verursacht MFN2, das für ein Mitochondrien-Außenmembranprotein kodiert, das an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen angereichert ist, eine axonale Neuropathie (CMT2A2), die mit einer Störung der ER-Mitochondrien-Interaktionen und dem Mitochondrienhandel verbunden ist39,41. Eine frühere histologische Untersuchung biopsierter Suralisnerven bei Patienten mit CMT/FSGS, die durch INF2-Mutationen hervorgerufen wurden, zeigte keine mitochondrialen Anomalien, anders als bei CMT, die durch MFN2-Mutationen verursacht wurden42. Ein erheblicher Teil der axonalen CMT-Gene hängt mit der mitochondrialen Mobilität zusammen, was darauf hindeutet, dass der Organellenhandelsdefekt ein zentraler Mechanismus für CMT38 ist (Ergänzungstabelle S7).

Unsere Studie mit Zellen, die INF2-Varianten exprimieren, legt nahe, dass mitochondriale Anomalien eine kritische Folge der Desorganisation des Aktin- und Mikrotubuli-Netzwerks sein können. Diese Veränderungen zusammen können die Lebensfähigkeit sowohl von Podozyten als auch von peripheren Neuronen beeinträchtigen (ergänzende Abbildung S19). Weitere Studien zur Bestimmung gewebespezifischer Mechanismen, die INF2-Störungen zugrunde liegen, könnten zu rationaleren therapeutischen Interventionen für CMT/FSGS führen und den Weg für die Entwicklung gezielter und personalisierter Medikamente ebnen.

Alle Verfahren entsprachen den ethischen Standards des Ausschusses für Humanstudien (institutionell und national) und der Helsinki-Erklärung. Die Einverständniserklärung aller Probanden und/oder ihrer Erziehungsberechtigten wurde eingeholt. Wir haben 20 japanische Familien und 50 sporadische Fälle mit FSGS43 aufgenommen. FSGS wurde durch das Vorhandensein segmentaler Sklerose in einigen Glomeruli definiert, und die Familien wurden auf der Grundlage von mindestens einem Individuum mit durch Biopsie nachgewiesenem FSGS und mindestens einem weiteren Blutsverwandten mit Proteinurie (definiert als Proteinurie gleich oder höher als ++ oder) ermittelt ein Urin-Albumin/Kreatinin-Verhältnis von mehr als 300 mg/gCr), fortschreitendes Nierenversagen oder durch Biopsie nachgewiesene Nierenerkrankung1,2,3,4,5. Wir haben alle Fälle von sekundärem FSGS aufgrund systemischer Erkrankungen (Fettleibigkeit, Bluthochdruck, HIV-Infektion usw.) oder anderer erblicher Nierenerkrankungen (Alport-Syndrom, Krankheit der dünnen Basalmembran, Fabry-Krankheit usw.) ausgeschlossen.

Genomische DNA wurde aus den peripheren Blutzellen mit dem QIAamp DNA Blood Isolation Kit (Qiagen) isoliert. Wir untersuchten eine Kohorte von 50 Familien mit SRNS mit oder ohne peripherer Neuropathie43. Indexpatienten wurden mittels Target-Panel- oder Whole-Exome-Sequenzierung gescreent. Die Co-Segregation von Varianten wurde durch Sequenzierung für Familienmitglieder bestätigt. Untersucht wurden alle seltenen und nicht-synonymen Kodierungsvarianten. Seltene Varianten wurden durch eine geringe Allelhäufigkeit von weniger als 1 % in den öffentlichen Datenbanken definiert. Bezüglich der Pathogenität der Variante wurden schädliche Auswirkungen durch mehrere Algorithmen vorhergesagt, darunter PolyPhen2, SIFT, M-CAP, LRT und der Mutation Taster. Für die Analyse und Interpretation der Sequenzdaten wurde ein systematischer, abgestufter Ansatz angewendet. Die genannten Varianten wurden gemäß der Empfehlung des American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) interpretiert und klassifiziert. Als pathogen oder wahrscheinlich pathogen eingestufte Varianten (Kategorie 1. oder 2. gemäß ACMG) wurden weiter analysiert.

Es wurden die cDNA-Konstrukte verwendet, in denen das menschliche INF2 voller Länge (NM_022489, die prenylierte CAAX-Isoform) mit entweder cMyc- oder GFP-Tags in die pcDNA 3.1-Vektoren subkloniert wurde. Für die Immunzytochemie und Western-Analyse wurde N-terminales cMyc-markiertes INF2 (GeneCopoeia Ex-Z4823-M43) als Wildtyp verwendet. Die einzelnen Basensubstitutionen der INF2-Varianten G73D, V108D, T161N, R218W und N202S wurden durch künstliche DNA-Synthese für Fragmente eingeführt, die von SalI- oder Hind III-Stellen flankiert sind (Genescript). Mutagenesereaktionen wurden für beide Stränge durch Sanger-Sequenzierung verifiziert. Für die Bildgebung lebender Zellen wurde der ORF-Klon von pcDNA3.1 + N-eGFP (Genescript ID: OHu18878C) als Wildtyp verwendet. Einzelnukleotidsubstitutionen p.G73D und A p.T161N-Substitution wurden durch künstliche DNA-Synthese von KpnI/XhoI-Stellen bzw. Enzymstellen eingeführt. Als Transfektionskontrolle wurde ein Vektor verwendet, der durcheinandergemischte Oligonukleotide enthielt (OmicsLink Expression Clone: ​​EX-NEG-M43).

Alle von uns identifizierten Varianten liegen innerhalb der DID, die eine autoinhibitorische Domäne im diaphanen Formin umfasst. In diesem Zusammenhang nutzten wir die Strukturen des selbst-autoinhibierten mDia1-DID/DAD-Komplexes (PDB:2F31), in dem der N-terminale DID mit dem C-terminalen DAD interagiert und so der Autoinhibition der mDia-Funktionen dient16. Die dreidimensionale Struktur des menschlichen INF2 wurde basierend auf der Kristallstruktur des mDia PDB 2F31 der Maus modelliert. Die Modellierung wurde mit der vergleichenden Modellierungsmethode unter Verwendung des Rosetta-Programms auf der Robetta-Plattform (http://new.robetta.org) durchgeführt. Um die möglichen strukturellen Auswirkungen von INF2-Mutationen zu bewerten, haben wir die INF2-Varianten basierend auf dem Wildtyp-Modell mithilfe der myPresto-Funktion mit 10.000 Minimierungsrunden modelliert. Die Grenzflächenfläche (Å) und die freie Energie (ΔG) pathogener INF2-Varianten wurden mithilfe der PISA-Software (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)44 vorhergesagt. Protein-Protein-Interaktionsdiagramme wurden vom PDBsum-Programm vorhergesagt. Für den Vergleich unserer modellierten Struktur und der AlphaFold-Struktur wurde das Modell des menschlichen INF2 aus der AlphaFold-Proteinstrukturdatenbank (https://alphafold.ebi.ac.uk) abgerufen.

MD-Simulationen des Wildtyp-INF2 und seiner Varianten wurden unter periodischen Randbedingungen unter Verwendung von GROMACS 2022.5, dem Amber ff99SB-Kraftfeld für Proteine ​​und Ionen und dem TIP3P-Modell für Wassermoleküle durchgeführt 46,47. Um das Proteinmodell herum wurden Wassermoleküle in einer 2 nm großen Box mit etwa 26.000 Wassermolekülen platziert. Die Ionen wurden bei 150 mM platziert, genau wie in vivo, und SLTCAP wurde verwendet, um die Anzahl der Ionen zu berechnen48,49.

Elektrostatische Wechselwirkungen wurden mit der Partikelnetz-Ewald-Methode (PME) mit einem Cutoff-Radius von 1,0 nm berechnet. Van-der-Waals-Wechselwirkungen wurden ebenfalls bei 1,0 nm abgeschnitten. Zur Fixierung der Bindungslänge wurde der LINKS-Algorithmus verwendet. Die Steepest Descent-Methode wurde zur Energieminimierung verwendet, die V-Rescale-Methode wurde verwendet, um die Gleichgewichtstemperatur auf 310 K zu steuern, und die Parrinello-Rahman-Methode wurde verwendet, um den Druck bei 105 Pa zu halten. Erstens wurde die Energie des Systems ermittelt durch Energieminimierung auf 1000,0 kJ/mol/nm minimiert, gefolgt von 200 ps NVT-Gleichgewicht und 800 ps NPT-Gleichgewicht, und dann wurde ein 500 ns langer Produktionslauf durchgeführt. Die Trajektorienausgabe wurde alle 1 ns extrahiert, wobei für alle Simulationen ein Zeitschritt von 2 fs festgelegt wurde (500.000 Schritte). Wir verglichen die Molekulardynamik zwischen Wildtyp-INF2 und pathogenen Varianten, indem wir die Bilder mit der VMD-Software erfasst und ausgerichtet haben (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Verfolgung der dynamischen Änderungen der Positionen von Resten in der DID- und DAD-Schnittstelle während 500 ns (250.000.000 Schritte). Für die RMSF-Analyse wurden die Ergebnisse nach 100 ns verwendet, als sich der RMSD der MD-Berechnung stabilisierte50.

HeLa-Zellen (RCB0007, RIKEN BRC) oder COS-7 (RCB0539) wurden in DMEM-Medium (Wako, 043-30085) mit 10 % fötalem Rinderserum gezüchtet. Die Zellen wurden unter normalen Kulturbedingungen mit 5 % CO2 und einer Temperatur von 37 °C gehalten und das Medium alle 48 Stunden gewechselt, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen vorsichtig mit PBS (–) gewaschen und mit 1 ml TrypLE Express (Gibco, 12605-101) trypsiniert.

Auf Deckgläsern gezüchtete Zellen (1 × 105 Zellen in einer Platte mit 12 Vertiefungen) wurden mit 1 μg Plasmidkonstrukten, entweder Wildtyp-INF2 oder pathogenen Varianten, unter Verwendung von TransIT-LT1 (Mirus, MIR 2300) transfiziert. Nach 8-stündiger Transfektion wurden die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4% PFA in PBS fixiert. Nach dem Spülen in PBS wurden die Zellen 10 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert und anschließend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 5 % Ziegenserum (Wako, 143-06561) blockiert. Mit cMyc markiertes INF2 wurde durch einen primären monoklonalen Anti-cMyc-Antikörper (1:1.000, Sigma, Nr. 4439) und einen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper (1:1.000, Anti-Maus-Alexa 488) 60 Minuten lang bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Zum Nachweis von Aktinfilamenten wurde der sekundären Antikörperlösung Phalloidin-konjugiertes fluoreszierendes 633 (1:50, Thermofisher, A22284) zugesetzt. Die Kerne wurden mit DAPI gegengefärbt und die Deckgläser mit Prolong Gold Antifade-Reagenz (Invitrogen, P36930) versehen. Die Immunfluoreszenzbilder wurden mit dem konfokalen Mikroskop Olympus FV3000 aufgenommen und konzentrieren sich auf Aktinfilamente im peripheren Bereich. Die Fotos wurden mit einem 63X/1,4 Plan Apo Oil in Kombination mit dem Großformat 1024 × 1024 Pixel aufgenommen.

Das Färbemuster der Stressfasern durch Phalloidin wurde anhand der morphologischen Merkmale in vier Untergruppen eingeteilt: Typ A (> 90 % der Zellfläche mit dicken Kabeln gefüllt), Typ B (mindestens 2 dicke Kabel verlaufen unter dem Zellkern und dem Rest der Zellfläche). gefüllt mit feinen Kabeln) Färbemuster, Typ C (keine dicken Kabel, aber einige Kabel vorhanden) und Typ D (keine Kabel sichtbar im zentralen Bereich der Zelle)22,23. Die Bilder wurden durch visuelle Inspektion oder automatisierte Klassifizierung durch uns maschinelles Lernen analysiert.

In 3–6 unabhängigen Experimenten wurden etwa 500 Zellen pro Transfektionskonstrukt gezählt.

Zur mitochondrialen Markierung in der Live-Bildgebung wurden Zellen 24 Stunden lang in einer Glasbodenschale (35 mm) mit einer Zelldichte von 3 × 10 Zellen ausgesät, um eine Konfluenz von 80 % zu erreichen, und das Medium wurde vor der Transfektion gewechselt. Die Zellen wurden mit 2,5 μg GFP-markierten INF2-Plasmiden unter Verwendung von Lipofectamine P3000 auf die Zellen transfiziert und 8 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen mit MitoTracker Red CMXRos (Thermofisher, M7512) bei einer Konzentration von 100 nM für 15 Minuten bei Raumtemperatur in phenolrotfreiem DMEM markiert. Die Bildgebung lebender Zellen erfolgte mit der konfokalen Mikroskopie Zeiss LSM700. Um die Dynamik der Mitochondrien zu visualisieren, wurden 10 Minuten lang alle 5 Sekunden Zeitrafferbilder aufgenommen.

Um das Mitochondrienmuster zu klassifizieren, wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die morphologischen Muster wurden quantifiziert, indem das Auftreten von Mitochondrien in drei Unterklassen (röhrenförmig, gemischt und fragmentiert) in transfizierten Zellen gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll klassifiziert wurde51,52. Um die 2D-Mitochondrien-Motilität zu analysieren, nahmen wir einen repräsentativen Stapel der Zelle (20 Zellen/jeder Typ) und maßen die mitochondriale Länge und maximale Intensitätsprojektionen der Z-Serie mit 0,5-μm-Schritten für den roten Kanal (MitoTracker)12. Die flachen Regionen der Zellen mit klar aufgelösten Mitochondrien wurden ausgewählt und 10 Mitochondrien pro Zelle mit dem Linientool in der NIH-Bildsoftware gemessen. Zur Intensitätsprofilierung wurden die Intensitätsprofile der mitochondrialen Signale entlang der Linien von ImageJ aufgezeichnet. Die Bilder wurden digital in 8-Bit-Graustufen konvertiert und mithilfe des Befehls „Surface Plot“ analysiert. Ein 3D-Diagramm wurde als Y-Achse rekonstruiert, die die Intensität (Grauwert) der Mitochondrien darstellt, während die X-Achse und die Z-Achse die Zellform bzw. -größe zeigten.

Wir haben unsere Netzwerkparameter auf den Standardparametersatz für das tiefe CNN, ALEXNET, initialisiert und dann die Parameter der letzten Schicht der Netzwerke auf unseren Daten per Backpropagation mithilfe von zwei NVIDIA GeForce RTX 2080Ti-Grafikprozessoren feinabgestimmt. Die Verlustfunktion wurde als Kreuzentropie zwischen der vorhergesagten Wahrscheinlichkeit und den wahren Klassenbezeichnungen definiert, und wir verwendeten die SGDM-Optimierung mit einer Lernrate von 0,0001 und einem Impuls von 0,9 zum Training der Gewichte.

Für die Klassifizierung der Mitochondrienmorphologie erhielten wir 1.024 × 1.024 Pixel von 34 Bildern für den INF2-Wildtyp bzw. die p.T161N-Variante. Nachdem wir die transfizierten HeLa-Zellbilder gemäß den GFP-Signalen beschnitten hatten, extrahierten wir zufällig 227 × 227 Pixel von 6.800 (100 × 34 × 2) Bildern aus den Originalbildern als ALEXNET-Eingabe und verwendeten 7 % (400/6.800) davon für Ausbildung.

Für die Aktinmorphologieklassifizierung erhielten wir 56 Wildtyp- und 79 Mutanten-exprimierende Zellbilder und verwendeten 3 % (400) der extrahierten 227 × 227 Pixel von 13.500 (100 × (56 + 79)) Bildern für das Training. Statistische Unterschiede in den Morphologie-Scores zwischen der Wildtyp- und der p.T161N-Variante wurden mit dem Wilcoxon-Rang-Summen-Test bewertet.

Um die Mikrotubuli anzufärben, wurden die Zellen zunächst mit Anti-Tubulin-Antikörper (1:300, Abcam, ab7291) markiert und anschließend mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper (1:1000, Abcam, ab150115) inkubiert. Durch visuelle Untersuchung der Immunfluoreszenzfärbung von β-Tubulin wurden subzelluläre Muster anhand der folgenden Kriterien in drei Untergruppen eingeteilt: (i) ausgerichtet in einer strahlenden Anordnung, die sich vom Zentrosomenbereich in der Nähe der Kerne (dem Mikrotubuli-Organisationszentrum) bis zur Peripherie erstreckte (normaler Subtyp), (ii) die mittlere, heterogene gemischte Konfiguration besteht aus normal strahlenden und dicken Bündeln, die parallel zueinander ungeordnet sind (mittlerer Subtyp), und (iii) am stärksten entlang der Längsachse der Zellen ausgerichtet (desorganisierter Subtyp)53. Alle Bilder wurden von mindestens drei unabhängigen Bewertern bewertet.

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test oder der einfaktoriellen ANOVA (SigmaStat, Version 3.1.1) durchgeführt. Die Überlebensanalyse wurde mit dem Log-Rank-Test (Prism 8; GraphPad) durchgeführt. Die paarweisen Unterschiede in einer proportionalen Verteilung von vier Aktin-Phänotyp-Kategorien zwischen Wildtyp-INF2 und Varianten wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests im R-Programm mit mehreren Testkorrekturen analysiert. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Die Zellen wurden mit einem Dounce-Homogenisator in RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 0,5 % Na-Desoxycholat, 1 % Triton Sigma). Die Lysate wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 13.000 g gereinigt. Nach 5-minütigem Erhitzen auf 95 °C in Laemmli-Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol wurden etwa 25 µg Proben pro Vertiefung geladen und durch 7,5 % SDS-PAGE-Gele getrennt. Die Proteine ​​wurden dann mit einer Mini-Trans-Blot-Zelle (Bio-Rad) (30 V, 6 Stunden) auf die Membranen der Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF) übertragen. Die Membran wurde 1 Stunde lang mit 5 % BSA blockiert und dann mit Primärantikörpern (Anti-cMyc 9106, 1:100 oder Anti-β-Tubulin, 1:300) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-T wurde die Membran dann mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (1:5.000) (NA931, Amersham) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Signale wurden durch Chemolumineszenz erfasst und mit einem Bildgebungssystem (LAS-4000, Fujifilm) erfasst.

Patient (II-1) bemerkte erstmals im Alter von 11 Jahren bei regelmäßigen Kontrolluntersuchungen eine Proteinurie und zeigte im Alter von 11 Jahren SRNS54. Die Nierenbiopsie ergab FSGS mit tubulär-interstitiellen Verletzungen. Trotz der immunsuppressiven Therapie entwickelte sie schließlich im Alter von 14 Jahren eine terminale Niereninsuffizienz. Mit 14 Jahren bemerkte sie erstmals Schwierigkeiten beim Herumlaufen. Die neurologische Untersuchung im Alter von 15 Jahren ergab, dass sie einen Schrittgang mit Hohlfußdeformität und distaler Muskelschwäche hatte. In den oberen und unteren Extremitäten wurde eine Muskelatrophie festgestellt und die tiefen Sehnenreflexe waren in den unteren Extremitäten vermindert. Es wurde keine sensorische Störung festgestellt.

Patient (II-3), ein jüngerer Bruder von Fall II-1. Es wurde keine elterliche Blutsverwandtschaft festgestellt. Im Alter von 6 Jahren zeigte sich bei ihm erstmals eine Proteinurie. Im Alter von 11 Jahren stieg die Proteinurie allmählich auf ein nephrotisches Niveau an. Im Alter von 11 Jahren unterzog er sich einer Nierenbiopsie mit der Diagnose FSGS und entwickelte schließlich im Alter von 15 Jahren eine terminale Niereninsuffizienz. Die neurologische Untersuchung im Alter von 12 Jahren ergab eine Schwäche der distalen Muskulatur Schrittgang und Muskelatrophie in den oberen und unteren Extremitäten. In den unteren Extremitäten waren die tiefen Sehnenreflexe vermindert. Es gab keine sensorischen Störungen in peripheren Neuronen.

Patient (II-1) bemerkte erstmals im Alter von 11 Jahren eine Proteinurie und entwickelte im Alter von 1455 Jahren ein nephrotisches Syndrom. Eine Nierenbiopsie im Alter von 14 Jahren ergab FSGS. Die Nierenerkrankung war resistent gegen eine Steroidtherapie und entwickelte sich im Alter von 16 Jahren zu terminaler Niereninsuffizienz. Seit ihrer Kindheit hatte sie Schwierigkeiten beim Gehen. Die Pes-cavus-Deformität wurde im Alter von 11 Jahren durch eine orthopädische Operation korrigiert. Die neurologische Untersuchung im Alter von 14 Jahren zeigte den Schrittgang mit asymmetrischer Atrophie und Schwäche in den Peroneus- und Schienbeinmuskeln. Ein Audiogramm ergab eine beidseitige Schallempfindungsschwerhörigkeit mit einem Hörverlust von 50 dB. Verschiedene Hörtests deuten darauf hin, dass die Hörstörung auf die Hörperipherie, die Cochlea oder die Hörnerven zurückzuführen ist.

Patient (II-1) zeigte bei regelmäßigen Kontrolluntersuchungen erstmals im Alter von 11 Jahren eine Proteinurie. Im Alter von 13 Jahren entwickelte er eine nephrotische Proteinurie mit einer Verschlechterung der Nierenfunktionen. Eine Nierenbiopsie im Alter von 14 Jahren ergab FSGS ohne Immunablagerungen. Er war mit Steroiden und Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitoren sowie Angiotensin-Rezeptor-Blockern in Kombination behandelt worden. Die Nierenerkrankung war resistent gegen die Steroide mit fortschreitender Funktionsverschlechterung und erreichte schließlich im Alter von 14 Jahren terminale Niereninsuffizienz. Im Alter von 15 Jahren bemerkte er Schwierigkeiten beim Gehen. Bei der neurologischen Untersuchung im Alter von 15 Jahren zeigte er Muskelschwäche und -atrophie vorwiegend in den unteren Extremitäten und litt an Schrittschritten Gang mit Senkfuß und Hohlfußdeformität. INF2-Varianten wurden in der Mutationsstudie von SRNS56 gemeldet.

Patient (II-1) zeigte bei regelmäßigen Kontrolluntersuchungen im Alter von 1454 Jahren erstmals eine Proteinurie. Bei der ersten Nierenbiopsie wurde MCNS diagnostiziert. Aufgrund der sich verschlechternden Nierenfunktion und der erhöhten Proteinurie unterzog er sich im Alter von 16 Jahren einer zweiten Nierenbiopsie, bei der eine FSGS-Histologie festgestellt wurde. Die Nierenerkrankung war resistent gegen eine Steroidtherapie und entwickelte sich im Alter von 17 Jahren zu terminaler Niereninsuffizienz. Im Alter von 10 Jahren bemerkte er erstmals Schwierigkeiten beim Gehen und wurde als CMT diagnostiziert. Bei der neurologischen Untersuchung im Alter von 17 Jahren wurde eine Muskelatrophie in den distalen Muskeln des Unterarms und der unteren Extremität festgestellt, wobei die distalen tiefen Sehnenreflexe fehlten. Er hatte eine fortschreitende Gangstörung mit Schrittgang. Es wurden weder eine geistige noch eine Hörbehinderung festgestellt. Die Biopsie des Peroneusnervs ergab eine Degeneration großer myelinisierter Fasern mit Zwiebelknollenbildung, die typischerweise beim demyelinisierenden CMT1-Subtyp beobachtet wird.

Die Forschung im Zusammenhang mit menschlichen Probanden entspricht allen relevanten nationalen Vorschriften, institutionellen Richtlinien und der Helsinki-Erklärung und wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss der Kansai Medical University (2008902) und jeder Zugehörigkeit genehmigt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im temporären Überprüfungs-Repository [Ueda & Quynh Submission Template] unter https://drive.google.com/drive/folders/1lvFWS6hiOVqPHuv-y8Sat-FiIMXSy3X_?usp=sharing verfügbar .

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Wir danken allen Patienten und ihren Familienangehörigen, die an unserer Studie teilgenommen haben. Wir möchten uns bei Dr. bedanken. Tatsuyo Takahashi und Masaki Miyoshi (Ajisu Kyoritsu Hospital) für die Bereitstellung klinischer Informationen. Diese Arbeit wurde durch die Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (20K08624 an H. T) und Challenging Exploratory Research (24659504 an HT) der Japan Society for the Promotion of Science unterstützt.

Hiroyuki Iida

Derzeitige Adresse: Toyama Transplantation Promotion Foundation, Toyama, Japan

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hiroko Ueda und Quynh Thuy Huong Tran.

Abteilung für Nephrologie, Zweite Abteilung für Innere Medizin, Kansai Medical University, 2-5-1 Shinmachi, Hirakata, Osaka, 573-1191, Japan

Hiroko Ueda, Quynh Thuy Huong Tran, Linh Nguyen Truc Tran und Hiroyasu Tsukaguchi

Abteilung für Genomanalyse, Institut für Biomedizinische Wissenschaft, Kansai Medical University, Hirakata, Japan

Koichiro Higasa

Abteilung für Molekulargenetik, Kansai Medical University, Hirakata, Japan

Yoshiki Ikeda und Naoyuki Kondo

Abteilung für Rechtsmedizin, Kansai Medical University, Hirakata, Japan

Masaki Hashiyada

Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Kansai Medical University, Hirakata, Japan

Chika Sato

Abteilung für Nephrologie, Abteilung für Medizin, Showa University Fujigaoka Hospital, Yokohama, Kanagawa, Japan

Yoshinori Sato

Abteilung für Pädiatrie, Medizinische und Pharmazeutische Universität Osaka, Takatsuki, Japan

Akira Ashida

Abteilung für Rheumatologie, Endokrinologie und Nephrologie, Medizinische Fakultät und Graduiertenschule für Medizin, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Saori Nishio

Abteilung für Nephrologie und Labormedizin, Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan

Yasunori Iwata

Abteilung für Innere Medizin, Zentralkrankenhaus der Präfektur Toyama, Toyama, Japan

Hiroyuki Iida

Abteilung für Pädiatrie, Medizinische Fakultät der Shinshu-Universität, Matsumoto, Japan

Daisuke Matsuoka & Yoshihiko Hidaka

Abteilung für Biochemie, Medizinische Fakultät, Medizinische und Pharmazeutische Universität Osaka, Takatsuki, Japan

Kenji Fukui

Hauptfach Naturwissenschaften, Graduate School of Science and Engineering, Kindai University, Higashiosaka, Japan

Suzu Itami

Abteilung für Energie und Materialien, Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, Kindai-Universität, Higashiosaka, Japan

Norihito Kawashita

Abteilung für Pädiatrie, Medizinische Fakultät der Kindai-Universität, Osakasayama, Japan

Keisuke Sugimoto

Abteilung für Pädiatrie, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japan

Kandai Nozu

Abteilung für pädiatrische Nephrologie, Tokyo Women's Medical University, Tokio, Japan

Motoshi Hattori

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HT hat diese Studie konzipiert und entworfen und HU, QTHT und HT haben das Manuskript geschrieben. YS, AA, SN, YI, HI, DM, YH, KS, KN, MH, sammelten klinische und pathologische Informationen des Patienten. HU, QTHT., LNTT führten genetische, strukturelle und zellbiologische Studien durch. KH hat die Deep-Learning-Analyse durchgeführt. MH und CS führten die Sequenzanalyse durch und unterstützten die Dateninterpretation. YI, KF, SI, NK führten die Struktur- und Molekulardynamikanalyse durch. NK war an den zellbiologischen Studien beteiligt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Hiroyasu Tsukaguchi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ueda, H., Tran, QTH, Tran, LNT et al. Charakterisierung der Zytoskelett- und Struktureffekte von INF2-Varianten, die Glomerulopathie und Neuropathie verursachen. Sci Rep 13, 12003 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38588-7

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Eingegangen: 12. Januar 2023

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38588-7

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