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Jun 01, 2023

Die Heilungsfähigkeit und das Osteogenesemuster der demineralisierten Dentinmatrix (DDM)

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13140 (2023) Diesen Artikel zitieren 195 Zugriffe auf Metrikdetails Demineralisierte Dentinmatrix (DDM) ist ein osteokonduktives und osteoinduktives Material mit

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13140 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Demineralisierte Dentinmatrix (DDM) ist ein osteokonduktives und osteoinduktives Material, das in klinischen Anwendungen erfolgreich zur Sinusbodenaugmentation und Alveolarkammaugmentation eingesetzt wird. Es setzt knochenmorphogenetische Proteine ​​(BMPs) und andere Wachstumsfaktoren frei, was DDM zu einem geeigneten Transplantationsmaterial macht. Die körnigen DDM-Partikel erschweren jedoch die Verankerung im Knochendefektbereich. Ziel dieser Studie war es, die biologischen Wirkungen und Osteoinduktivität der Kombination von DDM und Fibrinkleber (FG) in einem optimalen Verhältnis auf die Knochenheilung nach einem kritischen Knochendefekt in einem Tiermodell zu untersuchen. Die osteoblastische Zelllinie der Maus (MC3T3-E1) wurde mit verschiedenen Verhältnissen von DDM und FG co-kultiviert, um ihre Auswirkungen auf die Proliferation und Differenzierung von Osteoblasten zu untersuchen, wie durch alkalische Phosphatase (ALP)-Aktivität, Osteocalcin (OC)-Produktion und Bildung mineralisierter Knötchen angezeigt . Das optimale Verhältnis wurde dann für die weitere Untersuchung mit einem Modell mit Schädelkalottendefekten bei Kaninchen ausgewählt, in das DDM- oder DDM-FG1-Verbindungen (1 g: 0,1 ml) und DDM-FG2-Verbindungen (1 g: 0,5 ml) implantiert oder leer gelassen wurden für 2, 4, 8 und 12 Wochen, um die Regeneration von Weichgewebe und neuem Knochen zu untersuchen. Mikro-CT und histologische Analysen wurden verwendet, um die gesamten Transplantateigenschaften entsprechend den verschiedenen Heilungsperioden zu bewerten. Das Ergebnis von In-vitro-Studien zeigte, dass das Verhältnis von 1:0,1 mehr ALP-Aktivität und mineralisierte Knötchen induzierte, während das Verhältnis von 1:0,5 (DDM-FG kombiniert) zu bestimmten Zeitpunkten mehr Osteocalcin (OC) induzierte. Im Tiermodell war das 3D-Neuknochenvolumen in allen DDM-FG-Behandlungsgruppen nach 2, 4, 8 und 12 Wochen deutlich größer als das in der Blindgruppe. Darüber hinaus war das neue Knochenvolumen bei DDM-FG2 im Vergleich zu den anderen Gruppen in den ersten Wochen der Heilungsphase größer. In der histologischen Analyse bildeten sich Cluster von Osteoblasten neben den DDM-Partikeln, und in allen Gruppen wurde neu gebildeter Knochen beobachtet, was auf eine osteoinduktive Eigenschaft von DDM schließen lässt. Darüber hinaus deutete die nach 4 Wochen beobachtete größere Neukollagensynthese darauf hin, dass in der DDM-FG2-Gruppe eine frühe Knochenheilung induziert wurde. Diese Studie zeigte, dass die DDM-FG-Verbindung bei einem optimalen Verhältnis die osteogenen Aktivitäten und die Knochenregeneration steigert.

Bei der jüngsten Knochenaugmentation wurden verschiedene Arten von Knochentransplantationsmaterialien eingesetzt. Unter diesen Materialien gilt autologer Knochen, der Leitfähigkeit, Knocheninduktivität und Osteogeneseleistung aufweist, als Goldstandard für Knochentransplantationen1. Allerdings weisen körnige Knochentransplantate die Einschränkung auf, dass sie leicht von der Implantationsstelle verteilt und verstreut werden können. Eine Lösung besteht darin, sie mit einer Barrieremembran zu kombinieren, um eine raumhaltende Funktion zu erreichen. Dennoch sind alternative Möglichkeiten im Hinblick auf hohe Kosten und ethische Aspekte begrenzt. Daher haben diese Nachteile zur Entwicklung anderer Knochenersatzstoffe als alternative Transplantationsmaterialien geführt.

DDM ist eine Dentinart, die seit Kurzem als Knochentransplantationsmaterial verwendet wird. Es wird aus demineralisierten extrahierten Zähnen gewonnen und stellt im Wesentlichen demineralisiertes Dentin dar2,3. Obwohl die Matrix von Dentin und Knochen unterschiedliche Strukturen aufweist, weisen sie eine ähnliche chemische Zusammensetzung auf und können die Knochenbildung genauso konsistent induzieren wie die Knochenmatrix4. Sowohl Knochen als auch Dentin sind mineralisierte Gewebe, die aus etwa 18 % Kollagen (der größte Teil davon ist Kollagen Typ I), 2 % nicht kollagenen Proteinen (NCPs) und 70 % Hydroxylapatit (HA) bestehen. DDM kann mehrere Wachstumsfaktoren freisetzen, wie z. B. knochenmorphogenetische Proteine ​​(BMPs), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β) und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor ( FGF)5,6. BMPs sind die wirksamsten knocheninduzierenden Wachstumsfaktoren und gehören zur TGF-β-Superfamilie, bei der es sich um multifunktionale Zytokine handelt. BMPs können die verschiedenen Phasen des Knochenheilungsprozesses wie die Entzündungsphase, die Angiogenese, die Kallusbildung und den Knochenumbau erheblich induzieren7. VEGF verbessert die Angiogenese durch Induktionseffekte in Endothelzellen8. TGF-β1 kann im Tiermodell mit Knochendefekten die Bildung neuer Knochen induzieren9 und induziert kooperativ die osteogene Differenzierung mit BMPs10. Diese identifizierten Wachstumsfaktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Zellmigration in die Knochendefektregion, der Proliferation und Differenzierung zur Bildung von knochensynthetisierenden Osteoblasten11 und fördern zusätzlich die Angiogenese.

Fibrinkleber (FG), auch Fibrinkleber genannt, besteht im Allgemeinen aus zwei Hauptkomponenten: Fibrinogen und Thrombin. Fibrin ist eine aktivierte Form von Fibrinogen, die durch Thrombin aktiviert wird, und der aktivierte Fibrinkleber weist eine bestimmte Viskosität auf, die die Blutgerinnung und den Wundverschluss begünstigt12,13. Fibrin besteht aus miteinander verbundenen Fibrinogenen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Koagulation, Entzündung, Fibrinolyse, Gewebeumgestaltung, Zell- und Matrixinteraktionen sowie der Wundheilung. In dieser Studie haben wir das DDM-Granulat und den Fibrinkleber kombiniert, was zur Umwandlung des körnigen Knochentransplantationsmaterials in gelatineartigen, klebrigen Knochen führte, was die Integration des Partikel-Knochentransplantationsmaterials in den Alveolarknochen und die Verankerung im Knochendefekt unterstützte Oberfläche. Das Ziel dieser Studie bestand darin, das optimale Verhältnis von DDM und FG in der Verbindung zu untersuchen, um die Wirkung von DDM-FGs auf die Proliferation und Differenzierung osteoblastischer Zellen der Maus zu bestimmen. Darüber hinaus wurden die Verbindungen DDM und DDM-FG in einem Tiermodell der Schädelknochendefekte von Kaninchen untersucht, das auf Knochenheilungskapazität und Osteogenese untersucht werden kann.

Das gemahlene DDM wurde in blassem Gelb beobachtet (Abb. 1A1). Bei 40-facher Vergrößerung im REM schienen die DDM-Partikel trocken und locker zu sein (Abb. 1A2), während zwischen und auf der Oberfläche der DDM-Partikel in DDM-FG1 und DDM-FG2 einige FG-Schichten vorhanden waren (Abb. 1B2). ,1C2). Bei 500-facher Vergrößerung wurden typischerweise die meisten Dentinkanälchenöffnungen der DDM-Partikel beobachtet und freigelegt (Abb. 1A3). Bei 0,1 ml FG aggregierte das DDM, aber die Partikel sind in Abb. 1B1 locker, während DDM-FG2 mit 0,5 ml FG in Abb. 1C1 ein klebriges, knochenähnliches Aussehen zeigte, das mit einer Pinzette festgehalten werden kann . DDM (Abb. 1A3), DDM-FG1 (Abb. 1B3) und DDM-FG2 (Abb. 1C3) zeigten offensichtliche Dentinröhrenöffnungen.

Das Auftreten von DDM (A1–A3), DDM-FG1 (B1–B3) und DDM-FG2 (C1–C3). (A2, B2 und C2 mit Maßstabsbalken von 1000 μm; A3, B3 und C3 mit Maßstabsbalken von 100 μm).

Nach 72-stündiger Entkalkung wurde im Überstand Kalzium in einer Menge von 5,19 mmol/L gefunden, das aus DDM freigesetzte Kalzium stieg nach 72 Stunden weiter an. Die Freisetzung von Kalzium aus DDM bestätigte, dass das in dieser Studie verwendete DDM teilweise entkalkt war (Abb. 2A).

(A) Die Menge an Kalzium, die nach der Entkalkung aus dem menschlichen Dentin freigesetzt wird. (B) Die Zellproliferation von MC3T3-E1-Osteoblastzellen, die mit verschiedenen DDM-FG im Transwell-System kokultiviert wurden. (C, D) Eine Darstellung der Alizarin-Rotfärbung von Mineralknötchen und der quantitativen Daten von Mineralknötchen, die nach der Co-Kultivierung der MC3T3-E1-Zellen mit verschiedenen DDM-FGs für 14 und 21 Tage im Transwell-System gebildet wurden (Maßstabsbalken von 100). μm). (E) Die ALP-Aktivität, nachdem die MC3T3-E1-Zellen 3 und 7 Tage lang auf DDM-FGs ausgesät wurden. (F) Die Osteocalcin-Sekretion, nachdem die MC3T3-E1-Zellen mit verschiedenen Knochentransplantatmaterialien für 14 und 21 Tage im Transwell-System kultiviert wurden. Anmerkungen: Alle Signifikanz lag bei P < 0,05*, P < 0,01** P < 0,001***. FG (0,1 ml), DDM-FG1 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM mit 0,1 ml FG und DDM-FG2 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM mit 0,5 ml FG.

Die Kultur von MC3T3-E1 mit verschiedenen Transplantatmaterialien im Transwell-System zeigte ein zeitabhängiges Wachstum von MC3T3-E1 in allen Gruppen. Am 7. Tag induzierte DDM-FG1 eine deutlich höhere Zellproliferation als DDM-FG 2 und FG allein. Die Blindkontrolle ist etwas höher, unterscheidet sich jedoch statistisch nicht von der DDM-FG1-Gruppe. Dennoch waren die Zellproliferationen am Tag 7 in der Gruppe DDM, FG, DDM-FG1 und DDM-FG2 im Vergleich zur Blindkontrolle geringer, wie in Abb. 2B dargestellt.

Nachdem verschiedene DDM-FG-Verbindungen mit MC3T3-E1-Zellen im Transwell-System kokultiviert wurden. Die Ergebnisse sichtbarer Knötchen und die Färbungsintensität jeder Gruppe wurden in Abb. 2C, D quantifiziert. Am 14. und 21. Tag waren mineralisierte Knötchen unterschiedlicher Größe in der DDM-Gruppe, der DDM-FG1-Gruppe, der DDM-FG2-Gruppe und der FG-Gruppe sichtbar und zeigten sich in roter Farbe. Im Vergleich zur DDM-Gruppe gab es sowohl in DDM-FG1 als auch in DDM-FG2 mehr mineralisierte Knötchen in Anzahl und Größe. Die mineralisierten Knötchen wurden hauptsächlich in der DDM-FG1-Gruppe gebildet (P < 0,01), was höher ist als in anderen Gruppen. In der FG-Gruppe gibt es nur wenige mineralisierte Knötchen, die der Blindkontrollgruppe ähneln.

Die ALP-Aktivität von MC3T3-E1, kultiviert in osteogenem Medium mit DDM, DDM-FG1 und DDM-FG2, war im Vergleich zu MC3T3-E1 allein am Tag 3 und Tag 7 signifikant höher, wie in Abb. 2E gezeigt. Es wurde gezeigt, dass die Kombination von DDM mit FG im Vergleich zu DDM allein eine signifikant höhere ALP-Aktivität induziert. Darüber hinaus wurde die ALP-Aktivität in der DDM-FG1-Gruppe auf dem höchsten Niveau nachgewiesen. FG veränderte die ALP-Aktivität am Tag 3 oder Tag 7 nicht.

Die am 14. und 21. Tag festgestellte Osteocalcinsekretion war in der DDM-, DDM-FG1- und DDM-FG2-Gruppe signifikant höher als in der Kontroll- und FG-Gruppe (Abb. 2F). Die höchste Osteocalcin-Sekretion wurde am 14. Tag im DDM-FG2 gefunden und war am 21. Tag signifikant höher als im DDM und DDM-FG1 (P < 0,001).

Die Mikro-CT-Rekonstruktionsbilder (Abb. 3A) zeigten, dass es zwischen der 2. und 12. Woche zu einer neuen Knochenbildung kam, der Knochendefektbereich in der Blindgruppe jedoch nicht vollständig verheilt war. Am Rand des Knochendefekts begann sich neuer Knochen zu bilden, der sich als dünner und unregelmäßig geflochtener Knochen auszeichnete. Bei der DDM-Gruppe scheinen die DDM-Partikel locker zu sein und es wurden mehrere kleine Lücken im regenerativen Bereich gefunden, insbesondere im frühen Stadium der Knochenheilungsphase, d. h. 2 Wochen oder 4 Wochen (Abb. 3A). Unterdessen waren die DDM-Partikel in der DDM-FG1- und DDM-FG2-Gruppe gut gebunden.

(A) Die rekonstruierten 3D-Bilder der Knochendefekte nach der Implantation von DDM, DDM-FG1 und DDM-FG2 für 2, 4, 8 und 12 Wochen. (B) Der BV/TV-Parameter und (C) die Knochenmineraldichte der Knochendefekt-Parameteranalyse. Anmerkungen: Alle Signifikanz lag bei P < 0,05*, P < 0,01** P < 0,001***. DDM-FG1 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM mit 0,1 ml FG und DDM-FG2 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM mit 0,5 ml FG.

Der Anstieg von BV/TV wurde in den DDM-, DDM-FG1- und DDM-FG2-Gruppen nach 4 Wochen im Vergleich zur Blindkontrollgruppe signifikant festgestellt (P < 0,05) (Abb. 3B). Der BV/TV zeigte einen Anstiegstrend wie folgt: Blindkontrolle < DDM < DDM-FG1 < DDM-FG2 nach 12 Wochen. Die Dichte der Knochendefekte nahm im Frühstadium allmählich zu, während sie nach 12 Wochen abnahm (Abb. 3C). Interessanterweise wurde im Anfangsstadium der Knochenheilung (2 Wochen) die Knochendichte in DDM-FG2 signifikant induziert (P < 0,05). Später wurde die Knochendichte von DDM, DDM-FG1 und DDM-FG2 nach 4 Wochen signifikant induziert (P < 0,001). Allerdings begann die Dichte der Versuchsgruppe nach 8 Wochen leicht abzunehmen, und die Abnahme der Knochendichte aller Gruppen war nach 12 Wochen deutlicher. Dennoch war die Knochendichte aller behandelten Gruppen im Vergleich zu der der Blindgruppe nach 12 Wochen signifikant erhöht (P < 0,05). Dies kann auf die DDM-Partikel zurückzuführen sein, die den anfänglichen Dichtewert ergaben, während die neue Knochenregeneration begann, die Oberhand zu gewinnen, und in späteren Stadien ein Knochenumbau stattfand.

In der Blindgruppe gab es bis zu vier Wochen lang keine Hinweise auf die Bildung von hartem Gewebe im defekten Bereich, als am Rand des Knochendefekts dünnes, mit Mineralien verfärbtes Gewebe entdeckt wurde (Abb. 4A). Nach 8 und 12 Wochen wuchs sichtbar neuer Geflechtknochen vom Rand zur Mitte hin, und der dickere Knochen bildete sich mit der Periostabdeckung. Allerdings wurden die Gewebeverbindungen in der Blindgruppe nicht vollständig ausgefüllt. Die Verteilung der DDM-Partikel war in der DDM-Gruppe verstreut und die Partikel konnten nicht in der Implantationsposition bleiben. Bei DDM-FG1 und DDM-FG2 waren die DDM-Partikel gleichmäßig im Defekt verteilt und hatten im Vergleich zur DDM-Gruppe eine relativ glattere Oberfläche. Bei höherer Vergrößerung wurde festgestellt, dass vorhandene Dentintubuli in allen DDM-Gruppen nach 4 Wochen allmählich resorbiert wurden. Die umgebende Knochenneubildung wurde beobachtet, wobei sich viele Osteozyten in den Knochenlücken befanden (Abb. 4B). Nach 12 Wochen Implantation schien es sich bei der DDM-FG2-Gruppe um mehr neu gebildeten Knochen zu handeln als bei der DDM- und DDM-FG1-Gruppe.

(A) Die repräsentative H&E-Färbung der Knochendefekte, die mit verschiedenen DDM-Verbindungen nach 2, 4, 8 und 12 Wochen implantiert wurden; der Maßstabsbalken = 1000 μm; (B) DDM-Partikel wurden resorbiert und von Osteoid umgeben. Die neue Knochenbildung wurde gefunden; der Maßstabsbalken = 100 μm. (NB: neuer Knochen, Pfeil: die angrenzenden Osteoblasten, OD: Osteoid).

Die histologischen Befunde der Masson-gefärbten Schnitte ähneln denen der HE-gefärbten Schnitte (Abb. 5A), und an der DDM-FG1- und DDM-FG2-Implantationsstelle gab es reichlich neu gebildete Blutgefäße und Knochenkollagen-I-Fasern (Abb. 5B). Der Kollagen-I-Bereich aller Gruppen nahm im Laufe der Zeit zu. Sie war in der DDM-, DDM-FG1- und DDM-FG2-Gruppe von 2 bis 8 Wochen signifikant höher als in der Blindgruppe (P < 0,001) (Abb. 5C). Die durchschnittliche Fläche neuen Kollagens in der DDM-FG2-Gruppe wurde im Vergleich zur DDM-Gruppe signifikant früh nach 4 und 8 Wochen induziert (P < 0,01). Nach 8 Wochen war die Kollagenbildung in der DDM-FG2-Gruppe signifikant höher als die von DDM-FG1 (P < 0,05).

(A) Histologische Befunde von Masson-gefärbten Abschnitten (der Maßstabsbalken = 1000 μm); (B) Es gab mehr neue Blutgefäße und Col-I in den DDM-FG-Gruppen im Vergleich zur DDM-Gruppe nach 2, 4, 8 und 12 Wochen, der Maßstabsbalken = 100 μm) (Hinweis: neuer Knochen, OD: Osteoid). , Sternchen: Blutgefäße ). (C) Die quantitativen Daten des Kollagen-I-Bereichs der Knochendefekte nach 2, 4, 8 und 12 Wochen. Anmerkungen: Alle Signifikanz lag bei P < 0,05*, P < 0,01** P < 0,001***. DDM-FG1 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM mit 0,1 ml FG und DDM-FG2 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM mit 0,5 ml FG.

Der Einsatz von Knochenersatzstoffen und -materialien in der Zahnheilkunde hat in den letzten Jahren aufgrund der Fortschritte bei Zahnimplantaten und der steigenden Nachfrage nach der Wiederherstellung verschiedener Arten von Knochendefekten erheblich zugenommen. Demineralisierte Dentinmatrix (DDM), die aus extrahierten Zähnen gewonnen wird, wird aufgrund ihrer osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaften als Knochentransplantatmaterial bei Knochenaufbauoperationen verwendet, wie mehrere Studien bestätigen14,15. Darüber hinaus haben Tierversuche gezeigt, dass DDM biokompatibel und osteoinduktiv ist, vergleichbar mit entkalkter Knochenmatrix (DBM)16. Fibrinkleber (FG) ist ein biopolymeres Material, das eine hervorragende Biokompatibilität, eine kontrollierbare Abbaurate und die Fähigkeit besitzt, die Zelladhäsion zu verbessern und die Angiogenese zu verbessern. Das Material kann als Flüssigkeit an unregelmäßig geformten Stellen verabreicht werden, was seinen chirurgischen Nutzen erhöht17. Angesichts der biologischen Eigenschaften von DDM-Partikeln und FG und des Bedarfs an einem alternativen geeigneten Transplantatmaterial zielte die vorliegende Studie darauf ab, den optimalen Zustand der Kombination von DDM und FG für Osteogenese und Knochenregeneration in einem Kalvariendefektmodell bei Kaninchen zu untersuchen.

Die morphologischen Unterschiede zwischen DDM, DDM-FG1 und DDM-FG2 zeigten, dass sich die physikalischen Eigenschaften der DDM-Partikel mit zunehmendem FG-Verhältnis deutlich verbesserten. Das optimale Verhältnis von FG bewahrte die natürlich poröse Struktur von DDM. In einer früheren Studie zur Implantation des DDM in einen Schädelknochendefekt über 12 Wochen zeigte eine ultrastrukturelle Untersuchung der Schnittstelle zwischen DDM und dem umgebenden neuen Knochen eine Netzwerkverbindung der zellulären Prozesse der Osteozyten im neuen Knochengewebe mit dem DDM , die sich bis in die Dentintubuli erstreckte. Diese belastbaren Beweise deuten darauf hin, dass das Vorhandensein von Dentintubuli mehr Bereiche für die Zellanheftung bietet, den Substanzaustausch erleichtert und das Einwachsen von Blutgefäßen in das tieferliegende Material fördert18. In dieser Studie beobachteten wir Dentinkanälchenöffnungen in unserem selbst hergestellten DDM, DDM-FG1 und DDM-FG2 nach wirksamer teilweiser Demineralisierung. Es wurde berichtet, dass die biologische Wirkung von FG die Differenzierung von Osteoblasten (MC3T3-E1) und die Zellproliferation nach direkter Kokultur mit Fibrin verbessert19. Darüber hinaus veränderte die Thrombinkonzentration bei einer direkten Aussaat auf Osteoblasten dosisabhängig die Fibrinstruktur und bot eine geeignete Mikroumgebung für die Osteoblastenanheftung und -differenzierung, was durch den Grad der Kalziumablagerung, die ALP-Aktivität und den Runx220-Spiegel bestätigt wurde. Im Gegensatz zu früheren Berichten konnte FG allein in der vorliegenden Studie im Vergleich zu DDM oder DDM-FGs die Osteoblastenproliferation und -differenzierung nicht wirksam induzieren. Unterdessen verbesserte die Kombination von 0,1 und 0,5 ml FG mit DDM die Zelldifferenzierung weiter, indem sie eine höhere ALP-Aktivität, mehr Kalziumknötchen und Osteocalcin induzierte. Es ist möglich, dass die Zellen im Transwell-System unseres Experiments indirekt FG und anderen Materialien ausgesetzt wurden, was zu einer anderen biologischen Reaktion führte als die, die bei direkter zellulärer Bindungskapazität beobachtet wurde.

In einem Tiermodell wurde die Kombination von Calciumphosphatzement (CPC) mit FG in unterschiedlichen Verhältnissen in Knochendefekte von Kaninchen implantiert. Die 3D-Rekonstruktionsbilder zeigten, dass das Verhältnis 1:1 zu der größten Knochenbildung führte21,22. Die Anzahl der Gefäßabschnitte zeigte Folgendes: Das Verhältnis 1:1 war bei der Stimulierung einer Angiogenese am wirksamsten. Somit schien die Kombination von körnigem Material und FG im Verhältnis 1:1 (g/ml) eine signifikante Knochenregeneration und Angiogenese zu zeigen. Im Gegensatz zu einer früheren Tierstudie konnten in unserer Studie jedoch keine guten zellulären Reaktionen festgestellt werden, wenn ein Verhältnis von DDM (mg) und FG (ml) von 1:1 verwendet wurde, während andere Verhältnisse (1:0,1 und 1:0,5) zu Ergebnissen führten gute zelluläre Reaktionen. Darüber hinaus zeigten die zusätzlichen 0,1 und 0,5 ml FG zu DDM zusätzliche Wirkungen auf die Osteoblastendifferenzierung und förderten die Knochenregeneration und Angiogenese, wenn sie in Schädelknochendefekte von Kaninchen implantiert wurden. Es ist möglich, dass übermäßige Mengen an FG die biologischen Eigenschaften guter Transplantatmaterialien nicht immer ergänzen, da sie Dentintubuli vollständig blockieren und zum Verlust der porösen Struktur von DDM führen können, wodurch die Zellreaktionen und die Knochenregeneration beeinträchtigt werden.

Stabile Raumgestaltung und -erhaltung sind entscheidende Faktoren, die den Erfolg der Knochenregeneration bestimmen können23. Die optimale Partikelgröße ist entscheidend, um eine ordnungsgemäße Resorptionsrate während der Knochenrekonstruktion sicherzustellen und gleichzeitig das Defektvolumen für das Einwachsen neuen Knochens aufrechtzuerhalten24. Die Partikelgröße unseres selbst hergestellten DDM betrug 400–1000 μm, was eine gute Knochenregeneration im Knochendefekt ermöglichte, ähnlich wie in anderen früheren Studien25,26. Neben anderen Gerüstproteinen erwies sich FG als guter Träger für die BMP-2-Freisetzung und konnte die BMP-2-Freisetzungszeit verlängern27,28. Mittlerweile ist bekannt, dass BMP-2 von DDM produziert und langsam abgesondert wird. Mit der Anwesenheit von FG würde es in unseren DDM-FG-Gruppen eine geeignetere Umgebung für Osteogenese und Knochenheilung schaffen als DDM allein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl DDM-FG1 als auch DDM-FG2 eine gute Biokompatibilität zeigten und die Knochenregeneration fördern, indem sie die osteogene Differenzierung verbessern, die osteogene Mikroumgebung verbessern und die Kapillarisierung im Bereich des Knochendefekts erhöhen. Diese Verbindungen waren aufgrund ihrer besseren physikalischen Eigenschaften und der langsameren Abbaurate im Wirtsknochen praktischer. Basierend auf dem optimalen Verhältnis der kombinierten DDM-FGs verstärkte es daher zusätzlich zu DDM die osteogenen Aktivitäten und die Knochenregeneration, wie durch die In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse bestätigt wurde. Diese Studie liefert neue Erkenntnisse über eine Kombination von Transplantationsmaterialien, die DDM als wirksames Biomaterial für die Oralchirurgie verstärken können.

In diesem Experiment stammt die Quelle des für die DDM vorbereiteten Dentins aus nicht verfallenen Molaren, Prämolaren oder retinierten Zähnen von Patienten, die zur Zahnextraktion in die Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der Fakultät für Zahnmedizin der Mahidol-Universität kamen. Obwohl die Probenentnahme keine identifizierenden Informationen enthielt, wurde eine Einverständniserklärung aller Probanden und/oder ihrer Erziehungsberechtigten eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die von der Ethikkommission der Fakultät für Zahnmedizin/Fakultät für Pharmazie der Mahidol-Universität, Institutional Review Board (MU-DT/PY-IRB 2020/029.1007) genehmigt wurden.

DDM wurde mit einer modifizierten Methode29 hergestellt. Kurz gesagt, wurde kalte normale Kochsalzlösung (NS) verwendet, um den extrahierten Zahn zu waschen, und ein zahnärztlicher Hochgeschwindigkeitsbohrer wurde verwendet, um das Weichgewebe, den Zement und den Zahnschmelz vollständig zu entfernen (Abb. 6A). Anschließend wurden das restliche Dentin und das Pulpagewebe in kleine Partikel gemahlen (die Partikelgröße beträgt 400–1000 μm) (Abb. 6B), zum Entfetten 4 Stunden lang in Ethylalkohol/Diethylether bei 4 °C gegeben und anschließend zweimal mit gewaschen entionisiertes Wasser. Im Entmineralisierungsschritt wurden 72 Stunden lang bei 4 °C 0,6 mol/L HCl verwendet, dann wurden die Partikel wiederholt mit einem Ultraschallvibrator gewaschen. Zuletzt wurde das lyophilisierte DDM verpackt und 12 Stunden lang mit 25 kGy Kobalt-60-Strahlung sterilisiert und bei –20 ° C gelagert.

(A) Der extrahierte Zahn mit Zahnschmelz, Zement und Weichgewebe wurde entfernt; (B) Die gemahlenen DDM-Partikel mit einer Größe von 400–1000 μm; (C) Das frisch zubereitete FG und (D) vollständig gelatiniertes FG. (E) Das Transwell-Kultursystem, das in den Zellproliferations-, Mineralknoten- und Osteocalcin-Sekretionsexperimenten verwendet wird.

In diesem Experiment wurde das Porcine Fibrin Sealant Kit (Guangzhou Beixiu, China) verwendet (Abb. 6C, D). Die Hauptbestandteile von FG sind Fibrinogen (30,0 mg/ml) und Thrombin (650 IU/ml). Fibrinogen und Thrombin sind die Hauptwirkstoffe des Fibrinklebers, der aus gesundem Schweineplasma hergestellt wird, das abgetrennt, gereinigt und virusinaktiviert wurde.

Die Ca2+-Freisetzung wurde mit einem Calcium-Nachweiskit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) nachgewiesen, um das Ausmaß der Entkalkung von DDM von 1 bis 96 Stunden zu bestätigen.

Die DDM-Partikel und die DDM-FG-Mischverbindungen wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) (Hitachi SU8220 Japan) beobachtet. Nach der Gefriertrocknung wurden die Proben 24 Stunden lang mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden eine Dehydratisierung mit einem Ethanolgradienten und eine Lufttrocknung durchgeführt. Die Proben wurden mit Gold besprüht und morphologisch unter einem REM bei 12 kV untersucht.

Zwölf Stunden nach der Aussaat wurden MC3T3-E1 in Basalmedium kultiviert: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Streptomycinlösung, bei einer Temperatur von 37 °C, 5 % CO2 und einer Luftfeuchtigkeit von 70–80 °C %. Das Medium wurde alle drei Tage ausgetauscht. Das Co-Kultursystem wurde in Transwell (mit einer Porengröße von 8 μm) für die Zellproliferations-Kalziumknoten- und Osteocalcin-Experimente durchgeführt, wie in Abb. 6E gezeigt.

Ein Zellzählkit-8 (CCK-8, Dalian Meliun Biotechnology, China) wurde verwendet, um die MC3T3-E1-Zellproliferation quantitativ zu bewerten. Nachdem 500 μl Zellsuspension mit einer Dichte von 1 × 104 auf dem Transwell-System () in der unteren Kammer einer 24-Well-Platte für 4 Stunden gezüchtet wurden, wurden die verschiedenen DDM-FGs (DDM-FG1 repräsentiert das Verhältnis von 1 g DDM zu 0,1 ml FG) erhalten und DDM-FG2, das das Verhältnis von 1 g DDM zu 0,5 ml FG darstellt) wurden in die obere Kammer gegeben. Dann, nach 1, 3, 5 und 7 Tagen, wurde das ursprüngliche Kulturmedium durch 500 μl DMEM mit 10 % FBS, enthaltend 50 μl CCK-8-Reagenz, ersetzt. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden 100 μl der obigen Lösung von jeder Probe entnommen und in eine 96-Well-Platte gegeben. Es wurden drei parallele Replikate hergestellt. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Muliskan, Thermo, USA) bestimmt. Der Test wurde unabhängig voneinander dreimal wiederholt.

Zur Untersuchung der Knochen-ALP-Aktivität wurde ein Alkaline Phosphatase Assay Kit (Biyuntian Biotechnology, China) verwendet. Die Osteogenese wurde durch das osteogene Differenzierungsmedium (Oricell Therapeutics, China) induziert, das Basalmedium gemischt mit 200 μM Ascorbinsäure, 10 mM β-Glycerophosphat und 100 nM Dexamethason enthielt. Verschiedene DDM-FG-Verbindungen; DDM-FG1, das das Verhältnis von 1 g DDM zu 0,1 ml FG darstellt, und DDM-FG2, das das Verhältnis von 1 g DDM zu 0,5 ml FG darstellt, wurden vorbereitet und in Platten mit 6 Vertiefungen gegeben, bis FG vollständig gelatiniert war. MC3T3-E1-Zellen mit einer Dichte von 1 × 104/ml wurden direkt auf die Oberfläche verschiedener DDM-FG-Verbindungen geimpft und in einem Inkubator bei 37 °C kultiviert. Am 3. und 7. Tag wurde der Zelllysepuffer 25 Minuten lang mit 1200 U/min/min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand zum Testen entnommen. Nachdem jeder Vertiefung 100 μl Lösung zur Reaktionsbeendigung hinzugefügt worden waren, wurde die Absorption bei 405 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Muliskan, Thermo, USA) gemessen. Die Menge an ALP, die für die Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat erforderlich ist, um 1 μmol p-Nitrophenol pro Minute zu produzieren, wurde als Enzymaktivitätseinheit definiert, die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde berechnet. Der Test wurde unabhängig voneinander dreimal wiederholt.

2 × 104/ml MC3T3-E1-Zellen wurden in der unteren Transwell-Kammer einer 6-Well-Platte mit verschiedenen DDM-FG-Verbindungen (DDM-FG1, 1 g DDM mit 0,1 ml FG, DDM-FG2, 1 g DDM mit 0,5 ml) inokuliert FG) wurden in der oberen Transwell-Kammer hergestellt und in einem Inkubator bei 37 ° C kultiviert (wie in Abb. 6E gezeigt). Nach 14 und 21 Tagen wurden die verschiedenen Materialien in der oberen Kammer verworfen, die Zellen in der unteren Kammer wurden 5 Minuten lang mit 0,1 % Alizarinrot gefärbt, wobei die Anweisungen des Alizarinrot-Färbekits (Beyotime Biotechnology, China) befolgt wurden. Nach dem Fotografieren der Knötchen wurde 10 % Acetylpyridin in die 6-Well-Platte gegeben, 500 μl/Well, und die Lösung 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um mineralisierte Knötchen aufzulösen. Zuletzt wurde die Absorption der inkubierten Lösungen mit dem Mikroplatten-Lesegerät (Muliskan, Thermo, USA) bei 570 nm gemessen. Der Test wurde unabhängig voneinander dreimal wiederholt.

2 × 104/ml MC3T3-E1-Zellen wurden in die untere Kammer des Transwells eingeimpft, während DDM-FG-Verbindungen in unterschiedlichem Verhältnis in die obere Kammer gegeben und in den osteogen induzierenden Medien kultiviert wurden. Am 14. und 21. Tag wurden die verschiedenen Materialien in der oberen Kammer verworfen, das Kulturmedium gesammelt und 20 Minuten lang bei 1000 U/min/min zentrifugiert. Der Überstand wurde für den Osteocalcin-Assay unter Verwendung eines ELISA-Kits (Elabscience Biotechnology, China) entnommen. Die Intensität der Lösung wurde sofort gemessen (λ = 450 nm).

Das Tierversuchsprotokoll wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming, Kunming, Provinz Yunnan, China, genehmigt (kmmu2018029). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet werden. Für diese Studie wurden vierzig männliche erwachsene japanische Großohrkaninchen im Alter von 12 ± 3 Monaten und einem Gewicht von 3,5 ± 0,3 kg ausgewählt30. Die Kaninchen wurden während des gesamten Studienzeitraums täglich von einem akkreditierten Tierarzt überwacht. Während dieses Experiments wurden die Kaninchen nach Belieben mit Futter und Wasser gefüttert. Nach einer vierwöchigen Eingewöhnungsphase wurde die Behandlung von einem verblindeten Teilnehmer randomisiert, der das Ergebnis weder durchführte noch untersuchte und somit für die Studie „blind“ war.

Eine Vollnarkose wurde mit einer intramuskulären Injektion von 0,15 ml/kg Xylazinhydrochlorid31 (Jilin Huamu Animal Health Products, China) eingeleitet. Zwei erfahrene Chirurgen führten alle chirurgischen Eingriffe innerhalb von 30 Minuten durch und folgten dabei den Schritten in Abb. 7. Kurz gesagt wurden Weichgewebe und Kalvarienperiost entfernt (Abb. 7A). Zur Erzeugung von 4 Knochendefekten wurde ein Trepanbohrer mit 6 mm Durchmesser verwendet (Abb. 7B). Blank, DDM, DDM-FG1 (1 g DDM mit 0,1 ml FG) und DDM-FG2 (1 g DDM mit 0,5 ml FG) wurden hergestellt (Abb. 7C) und nach dem Zufallsprinzip in Knochendefektbereiche implantiert (Abb. 7D). Eine Ibuprofen-Suspension von 1 ml/Tag und eine Amoxicillin-Clavulanat-Kalium-Lösung von 75 mg/Tag wurden drei Tage lang nach der Operation in das Futter der Kaninchen gemischt. Jedes Kaninchen wurde in separaten Käfigen unter Standardlaborbedingungen bei einer Durchschnittstemperatur von 21 °C gehalten. Alle Kaninchen überlebten die Operation und waren bis zur Euthanasie gesund.

Die Vorbereitung der Schädelknochendefekte der Kaninchen und der vorgesehene Ersatz durch Transplantatmaterial.

Jeweils zehn Kaninchen wurden nach 2, 4, 8 und 12 Wochen durch eine Überdosis Ketamin32 eingeschläfert. Die Schädel mit dem chirurgischen Defektbereich wurden geschnitten und einer Probenvorbereitung für den µCT-Scan und die histologische Analyse unterzogen.

Die Knochenproben wurden in 4 % neutralem Formaldehyd eingeweicht und bei 20 °C gelagert. Die Proben wurden mit einem Mikro-CT-Scanner (SCANCO, Schweiz) mit einer Scanauflösung von 11,4 μm, Spannung (70 kVp), Strom (114 μA) bei einem Standarddrehwinkel von 360° für 150 Minuten gescannt. Nach dem Scannen wurden die Daten rekonstruiert (Bildverarbeitungssoftware μCT Ray V4.2) und eine quantitative Analyse aller Knochenparameter mithilfe der Software μCT Evaluation Program V6.6 durchgeführt, um das Wachstum von neuem Knochen in verschiedenen Phasen zu untersuchen.

Die 4 % neutrale gepufferte Formalinlösung wurde zur Fixierung der Proben verwendet und dann vor der histologischen Verarbeitung in 70 % Ethanol bei 4 °C gelagert. Die Schädeldecke der Kaninchen wurde in Rapid Cal eingeweicht. Immuno™ (BBC Biochemical, USA), pH < 1, für etwa 6 Tage, bis sie vollständig entkalkt waren. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser gespült, mit aufsteigendem Alkohol entwässert, in Xylol geklärt und in Paraffin eingebettet. Aus der Mitte des ursprünglichen Knochendefekts wurden serielle Schnitte mit einer Dicke von 5 μm geschnitten. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Masson-Trichrom-Farbstoffen gefärbt und dann unter einem Stereomikroskop (Nikon SMZ 745 T, Japan) und einem Lichtmikroskop (AXIO Lab.A1, ZEISS, Deutsch) beobachtet, um die Knochenheilung und den Kollagentyp zu untersuchen Ich hinterlege bzw. Die Bilder wurden dann mit der Software NIS-Elements F 4.60.00 64-Bit und ZEN 3.0 (Blue Edition) aufgenommen. Um die Kollagenfläche auf den Masson-Schnitten zu quantifizieren, wurden die drei Flächen bestimmter Quadrate im mittleren Feld jedes Objektträgers mit der Software Image-Pro Plus 6.0 berechnet.

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung \((\overline{x} \pm s \cdot d)\) dargestellt. Für die statistische Analyse wurde ANOVA und für den individuellen Vergleich der Tukey-HSD-Test verwendet. Die in diesem Experiment verwendete Statistiksoftware ist die Statistiksoftware Statistical Package for Social Sciences (IBM SPSS Statistics, USA). Das statistische Signifikanzniveau wurde auf einen p-Wert < 0,05 festgelegt.

Die tierethische Genehmigung für diese Studie wurde von der Ethikkommission der medizinischen Universität Kunming eingeholt (kmmu2018029). Die ethische Genehmigung der Humanstudie wurde von der Fakultät für Zahnmedizin/Fakultät für Pharmazie der Mahidol-Universität, Institutional Review Board, Thailand erteilt (Nr. MU-DT/PY-IRB 2020/029.1007).

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (DS) erhältlich.

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Dieses Forschungsprojekt wird von der Mahidol-Universität (Grundfonds: Geschäftsjahr 2023 vom National Science Research and Innovation Fund (NSRF), der International Dental Collaboration of the Mekong River Region (IDCMR) und dem General Joint Project der Kunming Medical University (Fördernummer 202101AY070001) unterstützt -194), großes gemeinsames Projekt der Kunming Medical University (Stipendium Nr. 202101AY070001-025), The Innovational Grant for Undergraduate Student (Stipendium Nr. 2021JXD178) und Sichuan Science & Technology Program (2021YFH0015). Wir danken auch Zichao Dai, Rongqiang Yang , Ying Huang, Rui Chen, Hengli Tong und Xiaomei Li für ihre technische Unterstützung und Assist. Prof. Dr. Nisarat Ruangsawasdi, Assist. Prof. Dr. Kajohnkiart, Prof. Natthamet Wongsirichat, Assist. Prof. Dr. Panjit Chunhabundit, Assist. Prof. Dr. Ratchapin Laovanitch Srisatjaluk für ihren Rat.

Abteilung für Oralbiologie, Fakultät für Zahnmedizin, Mahidol-Universität, 6 Yothi Street, Ratchathewi, Bangkok, Thailand

Jibo Bao & Dutmanee Seriwatanachai

Abteilung für Implantologie, Schule und Krankenhaus für Stomatologie, Medizinische Universität Kunming, Hecheng International Community, Gebäude C, Nr. 1088, Mitte der Hai Yuan Road, Bezirk Wuhua, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Jibo Bao & Zhigang Xie

Yunnan Key Laboratory of Stomatology, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Jibo Bao & Zhigang Xie

Abteilung der Chenggong Dental Clinic, Schule und Krankenhaus für Stomatologie, Chenggong New District, Medizinische Universität Kunming, Universitätsstadt, Yuhua Street, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Xunan Fu

Abteilung der zweiten Zahnklinik, Schule und Krankenhaus für Stomatologie, Medizinische Universität Kunming, Yuantong Street, Bezirk Wuhua, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Yirong Wu

Abteilung der Ersten Zahnklinik, Schule und Krankenhaus für Stomatologie, Medizinische Universität Kunming, Hongyun Street, Bezirk Wuhua, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Shengyin Yang

Abteilung für Parodontologie, Schule und Krankenhaus für Stomatologie, Medizinische Universität Kunming, Hecheng International Community, Gebäude C, Bezirk Wuhua, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Xiaobin Ren

Fakultät für Stomatologie, Medizinische Universität Kunming, Bezirk Chenggong, Chunrong West Road, Kunming, Yunnan, Volksrepublik China

Xingchen Fang

Staatliches Schlüssellabor für orale Erkrankungen, Nationales klinisches Forschungszentrum für orale Erkrankungen, Westchinesisches Krankenhaus für Stomatologie, Sichuan-Universität, Chengdu, Volksrepublik China

Quan Yuan

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BJ: Datenkuration; formale Analyse; Methodik; Software; Validierung; Visualisierung; Schreiben – Originalentwurf. XF: Methodik; Software. YW: Methodik; Software. SY: Methodik; Validierung; Visualisierung. XR: Methodik; Validierung; Visualisierung. XF: Methodik; Software. QY: Konzeptualisierung; formale Analyse; Finanzierungsakquise; Methodik; Projektverwaltung; Visualisierung; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. ZX: Konzeptualisierung; formale Analyse; Finanzierungsakquise; Projektverwaltung; Visualisierung. DS: Konzeptualisierung; Datenkuration; formale Analyse; Finanzierungsakquise; Methodik; Projektverwaltung; Ressourcen; Aufsicht; Visualisierung; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Zhigang Xie oder Dutmanee Seriwatanachai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bao, J., Fu, X., Wu, Y. et al. Die Heilungsfähigkeit und das Osteogenesemuster der Verbindung aus demineralisierter Dentinmatrix (DDM) und Fibrinkleber (FG). Sci Rep 13, 13140 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40258-7

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Eingegangen: 31. März 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 12. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40258-7

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